זיהוי ובידוד של Viable IL-17-מפריש תאים עכבר T

סיכום

הליך זה מתאר את זיהוי ובידוד של לויקוציטים עכבר TH17 כי להפריש באופן פעיל IL-17 על גירוי.

תקציר

המקים הפרשת ציטוקינים Assay הטכנולוגיה מאפשרת זיהוי של ציטוקינים המופרשים על רמת תא בודד ובידוד רגיש של ציטוקינים, מפריש תאים קיימא. כדי תווית IL-17-מפריש תאים, ההשעיה של תא בודד splenocytes העכבר מוכן ועורר על 37 מעלות צלזיוס עם PMA / ionomycin לעורר הפרשת ציטוקינים. כדי לעצור את הפרשת התאים ממוקמים אז על קרח נחשפים מגיב IL-17 מלכוד נוגדן ספציפי דו הנקשרת CD45 על פני התא של לויקוציטים וכן IL-17 כפי שהוא מופרש ותפס ליד פני התא. הפרשת הוא מחדש אשר נכתבו על ידי הגדלת הטמפרטורה ל 37 ° C ו-IL-17 הוא לכוד על ידי מגיב תפוס. הפרשה היא נעצרה שוב, על ידי הצבת תאים על הקרח. כדי לזהות את IL-17 לכודים, תאים מודגרת עם IL-17-נוגדן ספציפי שנייה מצומדות כדי ביוטין ו נוגדן Anti-ביוטין-PE. תאים כעת ניתן לנתח באופן ישיר על ידי cytometry זרימה או מוכן בידוד והעשרה על ידי תיוג הבאים עם Anti-PE microbeads מצומדות.

פרוטוקול

הכנת ריאגנטים

1. הפוך חוצץ המכיל PBS עם ארגון ה-BSA (0.5%), ו - 2 mM EDTA. בגלל בועות אוויר יכול לחסום MACS עמודות הפרדה, המאגר צריך להיות degassed ומאוחסנים ב 2-8 מעלות לפני השימוש.
2. אנו משתמשים RPMI 1640 בינוני המכילה סרום עכבר 5%. בינוני תרבות לא יכילו BSA או FCS, כמו תרכובות אלו תשנה את הספציפיות של גירוי התאים.
3. IL-17 עכבר Assay הפרשת - העשרה תא ערכת זיהוי מ-Miltenyi BIOTEC. הערכה מכילה את הרכיבים הבאים: IL-17 מגיב תפוס, IL-17 נוגדן איתור (ביוטין), Anti-ביוטין-PE, ו Anti-PE microbeads.

גירוי Splenocytes

1. פרוטוקול זה מתבצע בנוכחות של פקד שליליות וחיוביות, כגון splenocytes unstimulated ו counterstain עבור ותאי T. פרוטוקול זה מבוצעת באמצעות טכניקה סטרילית.
2. הכן ההשעיה תא בודד של העכבר splenocytes שהיו מבודדים באמצעות Dissociator ™ gentleMACS. ריכוז של תאים צריך להיות קבוע מראש באמצעות ספירת התאים. גלולה התאים ב × 200 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
3. בעקבות צנטריפוגה, לשאוב supernatant את גלולה באמצעות פיפטה. אין למזוג את הצינור כדי למנוע אובדן של גלולה.
4. עכשיו, resuspend התאים במדיום תרבות ולאחר מכן להוסיף את באר. הוסף בינוני מספיק ריכוז של 10,000,000 תאים לכל מ"ל ו - 5,000,000 תאים לס"מ מרובע.
5. כדי לעורר תגובה חיסונית בתאי resuspended שלנו, אנו להוסיף ionomycin (1 מיקרוגרם / מ"ל) ו PMA (10 ng / mL) המדגם ומערבבים את הפתרון על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. ואז בארות מסומנים בהתאם.
6. עכשיו, אנו דגירה התאים שלנו במשך 3 שעות ב 37 ° C, ללא ערבוב כדי להתחיל את תקופת גירוי. המשך IL-17 3 שעות מתחילת הניתוח של גירוי, ולכן התוכנית בהתאם.
7. כדי לעצור את הפרשה, התאים ממוקמים על קרח אנו אוספים את התאים מגורה על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה עם חיץ קר. תאים מועברים לאחר מכן מהבאר אל צינור ו נשטפים בפעם השנייה.
8. על מנת להבטיח כי כל התאים נאספים, זה רעיון טוב כדי לבדוק המנה שלך תחת מיקרוסקופ. אם התאים עדיין להישאר מחובר, אתה יכול לאסוף את התאים הנותרים על ידי שטיפת צלחת עם חיץ קר. גושים כל תא ההשעיה הסלולרי שלך ניתן להסיר באמצעות טרום הפרדה מסננים.

סימון תאים עם מגיב תפוס

1. זה הוא בעל חשיבות עליונה לציין, כי assay זה עובד באופן אופטימלי אם פחות מ 2% של IL-17-מפריש תאים קיימים.
2. אם ריכוז של IL-17 תאים להפריש צפוי להיות יותר מ 2% להתאים כמויות בהתאם.
   
3. מכשול אפשרי אחד של הליך זה הוא זיהום לחצות של מגיב תפוס, אשר יכול להתרחש במהלך תיוג כאשר נוגדן ספציפי דו נקשר לתא להפריש ללא טי ומלכודות IL-17 מופרש מן לימפוציטים שכנה, ובכך לייצר תוצאות חיוביות שגויות.
4. כדי לעקוף בעיה זו, חשוב לתאי להתקרר לפני תיוג לעבוד עם חיץ קר להאט דיפוזיה של IL-17 ו להימנע זיהום לחצות. בנוסף לשמירה על התאים קר, הם חייבים להיות כל הזמן בריכוז מוגדר.
5. כדי להתחיל את ההליך תיוג, אנו משתמשים 10,000,000 תאים צינור closable 15 מ"ל. אם המספרים גבוהים יותר התא צריך להיות בשימוש, פשוט בקנה מידה את כל הכרכים בהתאם. לאחר ריכוז אופטימלי תא התקבל, לשטוף את התאים על ידי הוספת 10 מ"ל של חיץ קר.
6. ספין למטה התאים ב 300 × גרם במשך 10 דקות בצנטריפוגה בקירור (2-8 מעלות צלזיוס).
7. בעקבות צנטריפוגה, לשאוב supernatant לחלוטין בעזרת פיפטה. אין למזוג supernatant כמו זה יוביל לאובדן התא כרכים מדויק. חזור על השלב כביסה אשר מורכב הוספת 10 מ"ל של חיץ צנטריפוגה קור, והשאיפה.
8. עכשיו יש לנו גלולה של טוהר הרצוי, resuspend התאים μL 80 של המדיום תרבות קר. לתייג אותם, נוכל כעת להוסיף 20 μL של מגיב עכבר IL-17 תפוס.
9. דגירה התאים למשך 5 דקות על הקרח.
10. לאחר תקופת דגירה 5 דקות על הקרח, להסיר את הצינור לדלל את התאים 10 מ"ל של מדיום 37 מעלות צלזיוס חם. ואז לאבטח את הצינור על Rotator Tube MACSmix ו דגירה צינור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות תחת תנועה רציפה. הגדלת הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס יהיה להתחיל מחדש הפרשת ציטוקינים.

סימון תאים עם נוגדן IL-17 Detection (ביוטין) ו Anti-ביוטין-PE

1. לאחר תקופת הפרשת 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, במקום צינור מיד על הקרח. זה יעצור הפרשת ציטוקינים. מכאן ואילך זה קריטי לשמור על התאים על הקרח.עבודה עם חוצץ קר ימנע זיהום לחצות של מגיב תפוס.
2. מלאו את הצינור עם חיץ צנטריפוגות קר בבית 300xg ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לשאוב supernatant לחלוטין. חזור על לשטוף את השלב עוד פעם אחת.
3. גלולה התא resuspended ב 80 μL של חיץ קר הצינור ממוקם על הקרח.
4. כדי למנוע מחייב נוקבים של הנוגדן, אנו ממליצים על תוספת של מגיב FCR 10μl חסימת לדגור על קרח דק '5. אז נוסיף 20 μL של נוגדן עכבר IL-17 Detection (ביוטין) כי הוא מצומדות כדי ביוטין ו דגירה במשך 10 דקות על הקרח.
5. שוב, לשטוף תאים כפי שעשינו לפני כן על ידי הוספת 10 מ"ל של חיץ צנטריפוגות קר בבית 300xg ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
6. עכשיו לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב μl 80 של המאגר הקר.
7. הוסף 20 μL של נוגדנים משני שלנו, Anti-ביוטין-PE.
8. מערבבים את התאים פתרון נוגדנים משנית, ושוב דגירה הצינור במשך 10 דקות על הקרח.
9. ברגע זה הדגירה השני הוא מלא, לשטוף את התאים עם חיץ 10 מ"ל ו - קר צנטריפוגות.
10. גלולה כעת ניתן resuspended ב μL 500 של המאגר הקר.
11. אם התאים יש להפריד לניתוח נוסף במורד הזרם, הם יכולים להיות מתויג מגנטית עם Anti-PE-microbeads ומופרד באופן ידני או אוטומטי באמצעות MACS עמודות מפרידים MACS.
12. השלמנו עתה את התוויות של splenocytes והם מוכנים לניתוח.

FACS ניתוח

1. לניתוח שלנו, נוכל להשוות את splenocytes מגורה unstimulated ידי cytometry הזרימה.
2. לפני ניתוח תזרים cytometric, התאים הם מוכתמים יודיד propidium על 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​לשער את התאים המתים. Analyzer ™ MACSQuant היתה עמוסה 200,000 תאים עבור כל דגימה ואנחנו עכשיו הולכים להסתכל על מגרשים פיזור של תגובתיות נוגדן יחסית הדגימות. שני השיקולים החשובים לניתוח של תאים נדירים - כמו IL-17 תאים חיובית - ידי זרימת cytometry הם:
   • קביעת השער על הלימפוציטים פיזור קדימה לעומת פיזור העלילה בצד
   • ו gating את התאים המתים (מוכתמים propidium יודיד) ו-B-תאים (אשר עלול לגרום מכתים רקע נוקבים) כדי לשפר עוד יותר את הרגישות של זיהוי
3. השתמשנו CD4-APC נוגדנים ותאי T לזהות את הנוגדן CD45R/B220-PerCP לזהות את התאים B. אנו רואים את המאפיינים פיזור קדימה בצד של הדגימות ולהחיל השער על אוכלוסיית הלימפוציטים.
4. השער השני היה ליישם כדי לראות את התאים המתים מוכתם ותאי B מוכתם (ציר Y). תאים אלה אינם נכללים בניתוח תא T.
5. בדוגמה זו, אשר היא למעשה שליטה שלילית שלנו, אנו יכולים לראות כי יש מעט מאוד IL-17 CD4 מפריש תאים חיובית T בדגימות unstimulated כ - 0.003% (איור 4). כאשר מסתכלים על האוכלוסייה מגורה תא T, אנו יכולים לראות מספר לא מבוטל של CD4 חיובי תאי T להפריש IL-17 - על 0.367% (איור 5A) לפני ההפרדה 60.76% לאחר הפרדה מגנטי עם MACS וטכנולוגיה (איור 5 ב).

דיון

תאים TH17 לשחק תפקיד אינטגרלי חסינות אדפטיבית את התגובה הדלקתית הם מרכיב מרכזי נהיגה דלקת אוטואימונית.

זה וידאו ומסמכים כיצד להשתמש בעכבר של Miltenyi IL-17 Assay הפרשת - העשרה תא ערכת זיהוי (PE). כשעושים הליך זה חשוב יש הערכת התדירות של IL-17-מפריש תאים לקראת ההתחלה שלך התא. ריכוז התא המתאים במהלך תיוג ועל הפרשת ציטוקינים תקופה מונע זיהום צולבות על ידי תאים אחרים השעיה שלך מבטיחה תוצאות אמינות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכה להעשרה של תאים וגילוי בבדיקה להפרשת IL-17 בעכברים (PE)	ריאגנט	Miltenyi Biotec	130-094-213	<קישור ל-"ערכה להעשרת תאים ולזיהוי של בדיקת הפרשת IL-17 בעכברים">ערכה להעשרה של תאים ולגילוי הפרשת IL-17 בעכברים
RPMI 1640	מצע	Miltenyi Biotec	130-091-440	<קישור ל-"RPMI 1640, מדיה לגידול תאיים">מערך RPMI 1640 (מדיום שאישורי) תיאור: מערך RPMI 1640 הוא מדיום בסיס המיועד לגידול של תאי למפציטים וסוגים שונים של תאי דם, וכן לסוגים מסוימים של תאי אפיתל. המדיום מכיל חומצות אמינו, ויטמינים ואנרגיה המותאמות לצורכי התאים. הוא נמכר ללא גלוטמין (L-glutamine) וללא תוספות של סרום, כדי לאפשר למשתמש להוסיף את הרכיבים הדרושים בהתאם לדרישות הספציפיות של הניסוי. מאפיינים: * פורמולה סטנדרטית לגידול תאי למפציטים. * ללא L-glutamine. * ללא סרום. * מותאם לשימוש במערכות בידוד ומיון תאים של Miltenyi Biotec. אחסון: יש לשמור בקירור בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
CD4-APC	ריאגנט	Miltenyi Biotec	130-091-611	<קישור ל-"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx">בדיקת CD4 באמצעות שיטת ה-Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) הערכה זו מאפשרת את הפרדתו של תאי CD4+ מתוך דגימות דם פריפרי. הקיט כולל נוגדני CD4 המסומנים בביוטין, נוגדני אנטי-מעכבי ביוטין המסומנים בחלקיקי מגנט, ועמודי הפרדה מגנטית. התהליך מבוסס על ספיחה סלקטיבית של תאי CD4+ על ידי החלקיקים המגנטיים, המאפשרים את הפרדתם מהשאר דגימת התאים. מרכיבי המוצר: - נוגדני CD4 המסומנים בביוטין - נוגדני אנטי-מעכבי ביוטין מסומנים בחלקיקים מגנטיים - עמודי הפרדה מגנטית - תמיסות שטיפה ותמיסות שימור פרוטוקול עבודה: 1. הכנת התאים: הכנת תרחיף של תאי מונונוקליאריים מדם פריפרי (PBMC). 2. סימון: הוספת נוגדני CD4 מסומני ביוטין לתמיסת התאים. 3. ספיחה מגנטית: הוספת נוגדני אנטי-מעכבי ביוטין מסומנים בחלקיקים מגנטיים לקשירת התאים המסומנים. 4. הפרדה: העברה של תרחיף התאים דרך עמוד הפרדה מגנטית. 5. איסוף: איסוף התאים שאינם CD4+ (החלק הבלתי קשור) ושטיפה של העמוד. 6. אלגאוציה (Elution): שחרור של תאי CD4+ מהעמוד המגנטי באמצעות תמיסת אלגאוציה. יישומים: - מחקרים אימונולוגיים - ניתוח תאי T - אבחון רפואי ומחקר קליני מילות מפתח: הפרדת תאים, CD4, MACS, ביוטין, סיווג מגנטי, תאי T.
CD8a-FITC	ריאגנט	Miltenyi Biotec	130-091-605	<קישור ל-"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx
תמיסת פרופידיום יודיד	ריאגנט	Miltenyi Biotec	130-093-233	<קישור אל="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">מ 용דן Propidium Iodide
ריאגנט לחסימת FcR, עכבר	ריאגנט	Miltenyi Biotec	130-092-575	<קישור ל-"מאגיי Blocking Reagent למסייעי FcR בעכברים">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx
ערכה להסרת תאים מתים	ריאגנט	Miltenyi Biotec	130-090-101
מסובב מבחנות MACSmix	מכשיר	Miltenyi Biotec	130-090-753	<קישור ל-"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
gentleMACS™ מפריד (Dissociator)	מכשיר	Miltenyi Biotec	130-093-235	<קישור ל-"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
ערכת התנעה ל-autoMACS Pro	מכשיר	Miltenyi Biotec	130-092-545	<קישור ל-"ערכה להתחלה עבור autoMACS Pro">ערכת התחלה של autoMACS Pro
עמודי MACS	כלי	Miltenyi Biotec		<קישור ל-"עמודות במבט חטוף">http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx
מפריד MACS	כלי	Miltenyi Biotec