הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידת הקרוב ממברנה פלזמה ו Global Dynamics סידן תאיים בתוך האסטרוציטים

12.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/1142

⸱

26 באפריל 2009

 , 
1Departments of Physiology and Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים כיצד למדוד ליד קרום והעולמית הדינמיקה סידן תוך תאי בתרבית בתוך האסטרוציטים באמצעות השתקפות פנימית מוחלטת מיקרוסקופיה epifluorescence.

תקציר

המוח מכיל ותאי גלייה. האסטרוציטים, סוג של תא גליה, כבר מזמן ידוע לספק תפקיד תומכת פסיבית נוירונים. עם זאת, הראיות עולה כי הגדלת האסטרוציטים יכולים גם להשתתף באופן פעיל תפקוד המוח דרך אינטראקציות פונקציונלי עם הנוירונים. עם זאת, היבטים בסיסיים רבים של הביולוגיה astrocyte נותרו שנויים במחלוקת, לא ברור ו / או נחקרו בניסוי. נושא אחד חשוב בדינמיקה של הארעיים סידן תאיים ב האסטרוציטים. זה רלוונטי כי סידן הוא הקים גם שליח שנייה חשוב כי זה הוצע כי הגבהים סידן astrocyte יכול לעורר את שחרורו של משדרי של האסטרוציטים. עם זאת, לא היתה כל תיאור מפורט או מספקת של סידן קרום ליד הפלזמה איתות האסטרוציטים. סך הקרינה השתקפות פנימית (TIRF) מיקרוסקופיה הוא כלי רב עוצמה כדי לנתח אירועים איתות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בתוך כ 100 ננומטר של קרום הפלזמה של תאים חיים. כאן, אנו משתמשים במיקרוסקופ TIRF ולתאר כיצד לפקח ליד הממברנה הפלסמטית והעולמית הדינמיקה סידן תוך תאי כמעט בו זמנית. חידוד נוסף יישום שיטתי של גישה זו יש פוטנציאל להודיע ​​על פרטים מדויקים של איתות סידן astrocyte. הבנה מפורטת של הדינמיקה סידן astrocyte עלול לספק בסיס להבנה אם, איך, מתי ולמה האסטרוציטים ונוירונים לעבור סידן תלויי אינטראקציות תפקודית.

פרוטוקול

ניסיונית נהלים

הליך הניסוי מורכב משני חלקים מרכזיים המתוארים בצורה צעד חכם למטה.

חלק 1: הכנת לתרבויות ASTROCYTE בהיפוקמפוס

בקצרה, מעורבים ההיפוקמפוס astrocyte-נוירון תרבויות הוכנו באמצעות פרוטוקול מבוסס היטב 1,2,3. אנו אופטימיזציה הליך להניב האסטרוציטים תרבותי בריא. כל הנהלים המפורטים להלן אמור להתבצע בסביבה סטרילית כמו מכסה המנוע זרימה למינרית.

הכנת coverslips

  • 22 מ"מ coverslips (VWR, 48380-068)
  • Poly-D-ליזין (PDL, סיגמה P0899), aliquots (1 מ"ג / מ"ל)
  • Laminin aliquots (20 מיקרוגרם / מ"ל): להוסיף 49 מ"ל של מים סטריליים עד 1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון laminin (Sigma L2020), לעשות aliquots 1.2 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C
  1. ממיסים PDL במים סטריליים (50 מיקרוגרם / מ"ל)
  2. החיטוי coverslips, לשטוף עם מים סטריליים במקום ב PDL (20 מ"ל עבור 100 coverslips). השאירו בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
  3. החלף PDL עם מים סטריליים (3 שוטף נרחב). לאחר מכן לייבש את coverslips ולאחסן ב 4 ° C.
  4. יום לפני ציפוי האסטרוציטים, coverslips המקום היחיד בבאר סטרילי בצלחת 6-באר (Multiwell Flat-Bottom צלחות עם מכסים, סטרילי מ BD Bioscience). שימי 400 μl של laminin על coverslip כל דגירה לילה, בחממה, כדי למנוע אידוי.

בתור

Dissection התקשורת:

  • 500 מ"ל מלח מאוזן ארל של פתרון (EBSS) (1X), נוזל (Invitrogen, 14155-063)
  • 5 מ"ל HEPES פתרון (Sigma, H0887)

בהיפוקמפוס התקשורת:

  • 412.5 מ"ל בינוני Essential Minimum (מ) (1X), הנוזל מכיל מלחים של ארל, אך לא אדום L-גלוטמין או פנול (Invitrogen, 51200-038)
  • 10 מ"ל גלוקוז (Sigma, D-(+), גלוקוז anhydrous SIGMA ULTRA G7528) 1 M ב ממ
  • 5 מ"ל פניצילין, סטרפטומיצין (Invitrogen, 15140-122)
  • Pyruvate 5 מ"ל נתרן פתרון (Sigma, S8636)
  • 12.5 מ"ל HEPES פתרון 1 M (Sigma, H0887)
  • 5 מ"ל N-2 מוסף (100x), נוזל (Invitrogen, 17502-048)
  • 50 מ"ל סרום סוס, חום מומת (Invitrogen, 26050-088)

Papain פתרון:

  • הוסף 5 מ"ל של התקשורת לנתיחה לתוך בקבוקון PAPAIN-022 וורטינגטון (LK003178; הריכוז הסופי, 20 U / ml) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.

  1. לערוף גורים בני חולדה P1 (בדרך כלל 2 גורים) בעקבות הנחיות בדקה ואושרה על ידי תקנות לאומיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים המקומי ועדת שימוש.
  2. הסרה של עור הגולגולת והמוח מקום בצלחת פטרי מלאות התקשורת לנתיחה קר.
  3. הוסר קרומי המוח, לנתח את שתי ההמיספרות ו לנתח hippocampi.
  4. קוצצים את hippocampi אל ~ חתיכות 1x1 מ"מ לעכל בפתרון papain על 37 מעלות צלזיוס במשך 11-13 דקות.
  5. לאחר פיסות הרקמה התיישבו, להסיר בזהירות papain להוסיף 5 מ"ל של מדיום בהיפוקמפוס כדי להסיר כל עקבות של האנזים. חזור על שלב זה resuspend במדיום בהיפוקמפוס (2 מ"ל).
  6. Triturate התאים ~ 5 פעמים עד שאין גושים שמאל, עם שלושה להבה מלוטש pipettes של טרחנים קטנים יותר ויותר (1000 מיקרומטר, 500 מיקרומטר ו ~ ~ 300 מיקרומטר).
  7. Triturated פעם אחת, להעביר את התאים דרך מסננת תא (גודל הנקבוביות, 70 מיקרומטר, BD Bioscience). ספירת התאים μl 10 ההשעיה. כוון את עוצמת הקול של המדיום בהיפוקמפוס כדי שיהיה 400,000 תאים / מ"ל.
  8. לשאוב את laminin coverslips, ולפני מכסה את יכולה יבש, 200 צלחת μl של ההשעיה תא לכל coverslip.
  9. עזוב אותם לצרף דקות 60 בחממה, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של מדיום בהיפוקמפוס בכל טוב.
  10. למחרת, לשאוב בינוני בהיפוקמפוס הישן כדי להסיר תאים מתים ופסולת ומוסיפים 2 מ"ל של מדיום מראש חימם בהיפוקמפוס טריים.

תחזוקה

Neurobasal התקשורת:

  • 500 מ"ל neurobasal (Invitrogen, 12348-017)
  • 10 מ"ל B27 בסרום תוספת חינם (Invitrogen, 17504-044)
  • 5 מ"ל פניצילין, סטרפטומיצין (Invitrogen, 15140-122)
  • 1.25 מ"ל L-גלוטמין (Invitrogen, 25030-149)

הזנת ה-astrocyte נוירון תרבויות פעמיים בשבוע עם המדיום neurobasal, החל ארבעה ימים לאחר ציפוי. Preincubate התקשורת על 30 דקות בחממה בבקבוק מאוורר לאזן את הטמפרטורה ו-CO 2.

חלק 2: הדמיה סידן

הקלטה חיץ בהיפוקמפוס: 110 mM NaCl, 5.4 mMKCl, 1.8 mM CaCl 2, 0.8 mM MgCl 2, 10 mM D-גלוקוז, HEPES 10 מ"מ (כל כימיקלים Sigma) 7.4 pH (מנוכה עם NaOH).

טוען אינדיקטור צבע סידן לתוך האסטרוציטים

  1. מניחים את התרבות בבאר בצלחת 6-טוב מלא 2 חיץ מ"ל בהיפוקמפוס הקלטה המכיל 2.5 מיקרומטר Fluo-4, בבוקר (Invitrogen, F-14217) ו Pluronic 0.05% ® פתרון ה-F-127 20% DMSO (Invitrogen, P-3000MP) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10-30 דקות.
  2. הסר Fluo-4 פתרון ולשטוף coverslips 3 פעמים עם חיץ הקלטה דגירה בהיפוקמפוס בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  3. מניחים את coverslip על החדר, לנקות את הצד השני של coverslip עם נוזל לניקוי עדשות.
  4. לשים טיפה אחת קטנה של שמן טבילה (שמן טבילה TYPE DF מ Cargille) על המטרה ולשים תא (תא פתוח coverslip 25 מ"מ עגול מבית וורנר מכשירים) על הבמה של המיקרוסקופ (אולימפוס IX71).
  5. תראו את התאים באמצעות שידור אור כדי לראות כיצד התאים נראים, ולקבל אותם אל המוקד. ואז להאיר את התאים עם 488 ננומטר מתוך monochromator (צבעוני V מ עד Vision) ולקבוע אם האות פלואורסצנציה של Fluo-4 הוא אחיד לזיהוי האסטרוציטים.
  6. השתמש EPI ו TIRF תאורה למדוד סידן האסטרוציטים.

TIRF מיקרוסקופיה

בקצרה, אנו משתמשים במיקרוסקופ IX71 אולימפוס מצויד במצלמה iXon אנדור EMCCD DV887DCS. השליטה של ​​עירור ורכישת התמונה מושגת באמצעות תוכנת TILLVision. הקורות של 454/488/515 ננומטר ארגון (100 mW) ו - 442 ננומטר של מצב מוצק (45 mW) לייזרים משולבים ומבוקר עם עד Polyline לייזר combiner, מעבה TIRF נמל כפול ולסנן tuneable acoustoptical הבקר (AOTF; כל מ עד Photonics) ו fed לתוך סיב הלהקה Kineflex רחבה לכניסה הקבל TIRF. אנו משתמשים 60x עדשת אולימפוס 1.45 NA להשיג TIRF. לזכות המצלמה מותאמת עבור כל astrocyte לספק את האות הטוב ביותר לתמונות רעש. הרקע והעקרונות של מיקרוסקופיה TIRF נבדקו לאחרונה 4, 5. מרבית הרכיבים האופטיים אנו משתמשים נרכשו מ עד Photonics, המהווה כיום חלק Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). עומק החדירה TIR ניתן לחשב משוואות להלן.

figure-protocol-1

d = חדירה לעומק

n1 = מקדם השבירה של זכוכית

= n2 מקדם השבירה של התא

זווית = של שכיחות

נאי = הצמצם המספרי של שכיחות


על מנת להבטיח את הלייזר מיושר בצורה אופטימלית עבור TIRF אנו מוצאים את זה שימושי כדי לצפות 100 ננומטר פלורסנט חרוז (Invitrogen, F8803). אנו מציגים עדיין מסגרות וקטעי וידאו של חרוזים עם EPI ו מיקרוסקופיה TIRF. כאשר ב TIRF, אחד מציין עלייה דרמטית האות לרעש-to-וחרוזים התצוגה דיפוזיה בראונית. אנחנו מוצאים את זה שימושי כדי לבחון את התנהגותם של 100 ננומטר חרוזים עם מיקרוסקופיה TIRF על בסיס קבוע (~ פעם בשבוע) כדי להיות בטוח כי TIRF אופטימלי מתרחש, ולא בתאורה אלכסונית נפגעת כי היה להתרחש אם זווית ביקורתית לא היו שווים α (ראה איור 1).

יישום ה-G-חלבון אגוניסטים לקולטן מצמידים

האסטרוציטים להביע מגוון של GQ מצמידים קולטנים 6, 7 כולל קולטני גלוטמט metabotropic ואת הקולטנים P2Y (אגוניסט, ATP, ADP). ההפעלה של רצפטורים אלו מוביל עליות משמעותיות רמות הסידן בתוך האסטרוציטים תאיים. למשל, אפשר בקלות להבחין הגבהים סידן תאיים במהלך היישום של ה-ATP (30 מיקרומטר) ל 8-10 האסטרוציטים. אנו משתמשים פתרון מהיר switcher מ וורנר מכשירים שנקרא VC-77SP Fast-Step System זלוף (http://www.warneronline.com/index.cfm). עם פתרונות בשיטה זו ניתן ליישם בתוך פחות מ ~ 10 מילישניות.

figure-protocol-2





figure-protocol-3

באיור 1. קריקטורה ותצלומים של הדמיה להגדיר. א מציג תצלום של המיקרוסקופ רכוב על airtable, ואילו (ב) מראה תמונה של האסיפה לייזר, בקרי ותיבות הקורה. ג מציג תמונה של הבמה מיקרוסקופ עם תא רכוב הדמיה. משמאל המכשיר זלוף מהיר ניתן לראות (יחד עם מנוע צעד צינורות תטא). מימין headstage של מגבר Axopatch 200A נתפסת. הקריקטורה schematizes נתיב האור להגדיר את מעלה כמה TIRF מושגת. הלייזר מתמקדת במישור המוקד האחורי של העדשה 60x NA 1.45 אובייקטיבי מעמדה מותאם מחוץ למרכז כך עולה לתוך השמן טבילה ב α זווית ביקורתית. בשלב זה קרן סובל השתקפות פנימית מוחלטת דועך עם λ מרחק (ראו משוואה בטקסט הראשי) לתוך המדיום של מקדם השבירה נמוך. במקרה זה מדובר החיץ שמסביב הקלטה האסטרוציטים ואת האסטרוציטים עצמם. התוצאה היא עירור אופטי (ובכך הדמיה) של מולקולות בתוך ~ 100 ננומטר של הממברנה הפלסמטית. בקריקטורה של התא הזה מוצג ירוק קולטנים "נרגש" קרום, ואילו אלה בתוך התא או על המשטח העליון של התא הם לא מתרגשים. החשבון המלא של מיקרוסקופיה TIRF סופק על ידי Steyer ו Almers 4.

figure-protocol-4

איור 2. תמונות של 100 ננומטר חרוזי ניאון רכשה עם EPI ו מיקרוסקופיה TIRF. א מציג תמונות EPI של שדה הראייה עם כמה עשרות חרוזי 100 ננומטר ניאון. נקודת החצים האדומים כדי חרוזים כי יש התיישבו על coverslip הזכוכית, בעוד ראשי חץ כחול הצבע חרוזים כי הם לשדר במים. ב 'מציג תמונה TIRF של אותו שדה הראייה כפי שמוצג א בתצוגה זו רק את החרוזים חסיד שמוצג על ידי החיצים האדומים הם גלויים. הסיבה לכך היא כי אלה התיישבו על coverlsip הזכוכית היו אפוא בתחום 100 ננומטר ~ חלוף. חרוזים שמוצג על ידי החצים הכחולים אינם בתוך האזור הזה הם בלתי נראים אפוא את התמונות TIRF. מגרשים התחתון להראות טיוח 3D של התמונות. ברור כי עלייה גדולה האות לרעש-to-מתרחש עבור חרוזים בתחום חלוף כאשר נצפתה על ידי מיקרוסקופ TIRF. למעשה, עבור תמונות אלו את האות לרעש עבור EPI היה 7.1 ± 0.6, ואילו TIRF זה היה 20 ± 0.7.

figure-protocol-5

איור 3. תמונות של האסטרוציטים עמוסה Fluo-4 צבע סידן אינדיקטור רכשה עם EPI ו מיקרוסקופיה TIRF. א EPI תמונות של שדה הראייה עם חמישה האסטרוציטים. ב התמונה TIRF של אותו שדה הראייה שמוצג ב הערה כי תמונות A ו-B הם שונים באופן משמעותי. הסיבה לכך היא כי עם TIRF תאורה רק הממברנה הפלסמטית האזורים הפרד קרוב coverslip הזכוכית הם צילמו. לוחות נמוך להראות ATP-עורר הארעיים סידן תוך תאי צילמו עם EPI ו מיקרוסקופיה TIRF.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

היא מבוססת היטב כי האסטרוציטים להציג הגבהים סידן תוך תאי. אלה מתרחשות באופן ספונטני, יכול להיות מופעלות על ידי הפעילות העצבית או על ידי יישום של אגוניסטים כדי להפעיל את הקולטנים על פני השטח astrocyte 11. נושא אחד חשוב במחלוקת היא האם astrocyte הגבהים סידן תוך תאי יכול לעורר את שחרורו של מולקולות איתות כי הפעלת הקולטנים על נוירונים 11, 12. זה שנוי במחלוקת כי יש כבר ראיות בעד ונגד השקפה זו, מודגשת כפי שהיידון 7, 13 ו - 11 מעבדות מקארתי בסקירות. על סמך האחרונות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי קרן הזיכרון Uehara של יפן (כדי ES) וכן קרן וייטהול, המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ ואת פרס שטיין אופנהיימר הקרן (עד BSK).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כיסויי זכוכית מיקרוסקופים עגולים, מס' 1, VWR®כליVWR international48380-068
Poly-D-lysine hydrobromideריאגנטSigma-AldrichP0899
Laminin מממברנת בסיס של סרקומה עכברית מסוג Engelbreth-Holm-SwarmריאגנטSigma-AldrichL2020
תמיסת מלחים מאוזנת של Earle’s (EBSS) (1X), נוזלריאגנטInvitrogen14155-063
תווך בסיסי מינימלי (MEM) (1X), נוזל המכיל מלחים של Earle’s, אך ללא L-glutamine או phenol redריאגנטInvitrogen51200-038
תמיסת Penicillin-Streptomycin נוזליתריאגנטInvitrogen15140-122
תמיסת Sodium pyruvateריאגנטSigma-AldrichS8636
תמיסת HEPES 1 MריאגנטSigma-AldrichH0887
תוסף N-2 (100X), נוזלריאגנטInvitrogen17502-048
סרום סוס, שעבר אינאקטיבציה בחוםריאגנטInvitrogen26050-088
PAPAIN-022ריאגנטWorthington BiochemicalLK003178
תווך Neurobasal™ (1X) נוזלי ללא Phenol RedריאגנטInvitrogen12348-017
תוסף B-27 נטול סרום (50X), נוזלריאגנטInvitrogen17504-044
L-Glutamine-200 mM (100X), נוזלריאגנטInvitrogen25030-149
מסנני תאיםכליBD Biosciences352350
פלטות BD Falcon רב-באירי בעלות תחתית שטוחה עם מכסים, סטריליותכליBD Biosciences353046
NaClריאגנטSigma-AldrichS7653
KClריאגנטSigma-AldrichP3911
CaCl2 hexahydrateריאגנטSigma-Aldrich21108
MgCl2 hexahydrateריאגנטSigma-AldrichM2670
HEPES free acidריאגנטSigma-AldrichH3375
D-(+)-glucoseריאגנטSigma-AldrichG7528
Fluo-4, AM תמיסה 1 mM ב-DMSOריאגנטInvitrogenF-14217
Pluronic® F-127 תמיסה 20% ב-DMSOריאגנטInvitrogenP-3000MP
שמן טבילה TYPE DFמיקרוסקופCargill Labs16242
תא פתוחה לכיסויי זכוכית עגולים של 25 mm, נפח 100 μlכליWarner Instruments64-0362 (RC-21BDW)
פלטפורמת P-2 לתאי Series 20, ללא מחמםכליWarner Instruments64-0278 (P-2)
FluoSpheres מיקרוספירות עם מודיפיקציית קרבוקסילאט, 0.1 μm, פלואורסצנטיות צהוב-ירוק (505/515) 2% מוצקיםריאגנטInvitrogenF8803

מקורות

  1. Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
  2. Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
  3. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J Vis Exp. 19, (2008).
  4. Steyer, J. A., Almers, W. A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).
  5. Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).
  6. Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signalling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
  7. Haydon, P. G. GLIA: listening and talking to the synapse. Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).
  8. Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).
  9. Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).
  10. Bowser, D. N., Khakh, B. S. Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes. J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).
  11. Agulhon, C. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
  12. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
  13. Lee, S. Y., Haydon, P. G. Astrocytic glutamate targets NMDA receptors. J Physiol. 581, 887-888 (2007).
  14. Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons. J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).
  15. Cahoy, J. D. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28, 264-278 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TIRF
מדידת הקרוב ממברנה פלזמה ו Global Dynamics סידן תאיים בתוך האסטרוציטים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.