מאמר שיטה

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח על מדיה מוצק

DOI:

10.3791/1152

⸱

12 במאי 2009

 , 
1Department of Pathology, University of Washington, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Washington

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה אנו מציגים את פרוטוקול כללי למדידת אורך החיים של נמטודות שמרו על התקשורת עם מזון מוצק-UV הרג חיידקים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזדקנות היא תהליך ניוונית המאופיינת הידרדרות מתקדמת של רכיבים סלולריים האברונים וכתוצאה מכך התמותה. נמטודות

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלק 1: הכן את הצמיחה נמטודות מדיה (NGM) צלחות

סעיף זה מתאר את הכנת לוחות NGM מוצק לשימוש בניסוי תוחלת החיים. ניסוי בסיסי תוחלת החיים מחייבת שני סוגים של לוחות: לוחות NGM סטנדרטיים, אשר אינם מכילים תוספים Amp / FUDR צלחות, אשר שניהם אמפיצילין (AMP) ו fluorodeoxyuridine (FUDR) הוסיף NGM. אמפיצילין המשמש על מנת למנוע זיהום חיידקי זרים. FUDR מעכב את חלוקת התא, מפחית ייצור ביצים, ומונע ביצים הבקיעה. השימוש FUDR לניתוח אריכות ימים אינו משפיע על תוחלת החיים הבוגרים ומסיר את הצורך להעביר תולעים כל כמה ימים על מנת להפריד אותם מן הזחל גדל. שני הסוגים של צלחות הם זורעים עם E. coli OP50 חיידקים, אשר נהרגה לאחר מכן ע"י חשיפה UV.

  1. הכן NGM (ראה סעיף 5 למתכון והערות אחסון) ו צלחות פטרי התווית. יהיה עליך 1 60 מ"מ צלחת פטרי לכל 10 מ"ל של NGM. אם אתה מתחיל עם NGM מוצק מוכן בעבר, המשך לשלב 1.2. אם אתה מתחיל עם NGM autoclaved טרי, דלג לשלב 1.4.
  2. להמיס לחלוטין NGM מוצק על ידי במיקרוגל גבוה 30 פולסים השני. מערבולת התקשורת בין פולסים כדי למנוע בועות גז בלחץ מהבניין למעלה.
  3. המקום NGM נוזלי 55 ° C אמבט מים או על הספסל להתקרר.
  4. לאחר NGM מגיע 55 ° C להוסיף 33 μL FUDR של 150 מ"מ ו 100 μL של אמפיצילין 100 מ"ג / מ"ל ​​ל -100 מ"ל NGM (עבור מגבר / FUDR צלחות) ו מערבולת לערבב. עבור צלחות NGM ללא תרופות נוספות להמשיך ישירות לשלב 1.5.
  5. באמצעות טכניקה סטרילית, פיפטה 10 מ"ל NGM לתוך כל צלחת פטרי 60 מ"מ. הימנע ויוצרים בועות אם זה אפשרי. אם הבועות לעשות טופס, הם יכולים להיות צץ באמצעות קצה פיפטה.
  6. השאירו צלחות על הספסל עם מכסים על מנת לאפשר NGM לחזק ויבש. במידת האפשר, לצאת צלחות על הספסל במשך 2 ימים לפני הוספת חיידקים, אבל יום 1 יעבוד אם צלחות נחוצים מוקדם יותר.
  7. ביום שלפני צלחות הסיום ייבוש, נוזל זרע תרבות LB עם מושבת יחיד מתוך קו חדש של E. coli OP50 חיידקים על אגר LB. אתה צריך להכין לפחות 1 מ"ל של תרבות OP50 לילה לכל צלחת 60 מ"מ.
  8. OP50 המקום והתרבות 37 ° C שייקר ולאפשר לחיידקים לגדול בין לילה (תרבות צריכה להגיע הרוויה).
  9. גלולה OP50 על ידי חיידקים גרם ספינינג ב 3500 במשך 10 דקות.
  10. הסרה של 90% של חיידקים supernatant ו resuspend להתרכז תרבות 10x.
  11. פיפטה 100 μL של התרבות 10x OP50 מרוכזת למרכז צלחות NGM הקרושה. צלחות מערבולת בעדינות להתפזר התרבות חיידקים אם יש צורך (רצוי חיידקים אמור לכסות את האזור המרכזי של NGM מבלי להתקרב לחומות צלחת). נסו להימנע מלגעת קצה פיפטה אל פני השטח של NGM, כמו פגמים על פני השטח של התקשורת לאפשר תולעים להתחפר לתוך NGM.
  12. השאירו צלחות על הספסל לילה כדי לאפשר התרבות חיידקים להתייבש על NGM מוצק (בדרך כלל לוקח בערך 24 שעות).
  13. יבש פעם, לחשוף את פני השטח של הלוחות למינון UV מספיק כדי לעצור את הצמיחה של החיידקים. אם אתה משתמש Stratalinker UV Stratagene 2400:
    • המקום צלחות Stratalinker ולהסיר העפעפיים
    • סגור את הדלת ולהדליק Stratalinker
    • לחצו על "אנרגיה"
    • הזן "'9999 באמצעות לוח המקשים
    • לחץ "התחל"
    • הצלחות יהיו חשופים UV למשך כ 5 דקות
  14. צלחות עם חיידקים-UV נהרגו ניתן לאחסן במהופך על 4 מעלות צלזיוס עד חודש 1.

חלק 2: ביצוע ביצה מתוזמן הנחת לרכוש גיל מסונכרן האוכלוסייה של חיות

בסעיף זה אנו ליצור אוכלוסייה של תולעים עם תאריך לבקוע נפוץ. מטרה זו מושגת על ידי מתן מבוגרים פעיל reproductively להטיל ביצים על צלחת לתקופה מוגדרת של זמן המאפשר ביצים אלה להתפתח.

  1. (אופציונאלי) העברה של כ 20 תולעים בוגרות צעירות צלחת NGM טריים ללא FUDR. השאירו צלחות של 25 ° C על מנת לאפשר תולעים להפיץ ולאכול את כל האוכל חיידקי. אחרי האוכל חיידקי כבר צרכו תולעים שזה עתה בקעו ייכנסו צמיחה נעצר בשלב dauer. תתחיל לראות את הזחל dauer סביב בתוך שבוע, תלוי איך אתה מעביר תולעים רבים הצלחת בתחילה. הזחל Dauer יכול לשמש את הצעדים הבאים במשך חודש עד 1.
  2. (אופציונלי) 20-30 העברת dauer הזחל לצלחת NGM טריים ללא FUDR. בנוכחות של הזחל מזון dauer יהפכו למבוגרים פעיל reproductively בתוך 2 ימי ולהישאר פעיל reproductively במשך כמה ימים לאחר מכן ב 25 ° C.
  3. העברת 10-15 מבוגרים פעיל reproductively לצלחת NGM טריים ללא FUDR. צלחת זו נקראת הנחת ביצה מתוזמן (תל) צלחת.
  4. השאירו את הצלחת תל במהירות של 25 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות על מנת לאפשר tהוא זמן תולעים להטיל ביצים.
  5. הסר תולעים בוגרות מהצלחת טל. פלייט יכולה להיבדק חזותית לביצים לפני הסרת מבוגרים. אם התולעים לא הניחו מספר מספיק של ביצים בצלחת תל ניתן להשאיר על 25 מעלות צלזיוס עד לסך של 24 שעות לפני הסרת תולעים בוגרות.
  6. המקום תל צלחת ב 20 ° C עד הביצים יש בקעו והתולעים פיתחו בשלב הזחל L4 (זה בדרך כלל לוקח 2 ימים בטבע סוג C. elegans, אבל יכול להימשך זמן רב יותר עבור זנים עם פנוטיפים התפתחות איטית).

חלק 3: בעלי חיים ציון על תוחלת החיים

בסעיף זה נעקוב אחרי גיל מסונכרן אוכלוסיית תולעים מן חלק 2 עד שהם מתים. תולעים מתוחזקים על מגבר / FUDR צלחות כדי למנוע ייצור ביצה זיהום חיידקי ונחשבים מתים כאשר הם אינם מגיבים לגירויים חיצוניים.

  1. העברת L4 זחל אל צלחות seeded Amp / FUDR. עבור כל מתח או מצב שנבדק, הוא אופייני להקים 2-3 צלחות עם 25-30 תולעים לכל צלחת. תמונות של ג בשלבים elegans החיים ניתנים לעיון (איור 1). 1
  2. המקום Amp / FUDR צלחות על 20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  3. לאחר 24 שעות חזותית להעריך תולעים, מדיה, וחיידקים. העברת תולעים Amp / FUDR צלחות טרי אם כל אחד מאלה הוא ציין:
    • תולעים אוכלים את רוב האוכל חיידקי. בתחילת את תוחלת החיים תולעים הניסוי יצטרכו להיות מועברים 1-2 פעמים בשבוע כדי למנוע מחיידקים מתרוקן.
    • מספר לא מבוטל של הזחלים נמצאים. זה בדרך כלל אינדיקציה כי תולעים הועברו Amp / FUDR צלחות כמבוגרים במקום L4s צעירים הצליחו יטילו ביצים לפני FUDR לתוקף. FUDR בדרך כלל למנוע את הזחלים מן גדל לתוך מבוגרים מלא, אבל מדי פעם כמה יגדל מבוגרים להתבלבל עם חיות הניסוי.
    • החיידק חי / גידול הם נצפו. בדרך כלל, שילוב של מגבר ו-UV הרג תבטיח כי אין חיידקים חיים לזהם את הניסוי, אבל מדי פעם זה קורה.
    • צמיחת הפטרייה הוא ציין על התקשורת. אם נתפס מוקדם מספיק, צמיחה פטרייתית בדרך כלל ניתן לגזור בעזרת קצה פיפטה או מרית. לאחר שהוא גדל להיות גדול יותר מאשר כמה מילימטרים קוטרו זה בדרך כלל קל יותר להעביר את התולעים לצלחת חדשה.
    • שימוש היקף לנתיחה, לקבוע אם התולעת כל חי או מת.
    • לטפוח בעדינות את הצלחת. התולעת היא חיה אם היא נעה בתגובה הקשה.
    • אם התולעת אינו מגיב הקשה על הזום, צלחת על אזור הראש.
    • לטפוח בעדינות את ראש התולעת עם לבחור להעביר פלטינה. ציון התולעת כמו מת אם זה לא מגיב על ידי הזזת הראש.
    • תולעים המלח ניתן להסיר מן הצלחת.
  4. תעדו את התאריך ואת מספר תולעים, כי הם חיים ומתים.
  5. חזור צלחות עד 20 ° C.
  6. חזור על שלבים 3.3 עד 3.6 בכל 2 עד 3 ימים עד תולעים כל מתו.

חלק 4: תוצאות נציג.

הנתונים הגולמיים המיוצר על ידי ניסוי תוחלת החיים נמטודות רשימה של תאריכים עם מספרים המקביל תולעים, כי הם חיים ומתים עבור כל זן נבדק. מספר ותולעים למות בכל יום הוא בדרך כלל הפוך כדי לחשב את שיעור תולעים חי בכל יום (איור 2 א), אשר זממו גרפית כמו עקומת ההישרדות (תרשים 2B, יום הנחת ביצה מתוזמן נחשב היום 0 ). תוחלת החיים של התולעת בנפרד במחקר ניתן לחשב מהסכום של תולעים שמתים על כל יום המשמשים לחישוב תוחלת החיים החציונית מתכוון להשוואה בין זנים. ספירה של מספר תולעים חי בכל יום אינו משמש ישירות ניתוח תוחלת החיים. תולעים שמרו על התקשורת מוצק מדי פעם "לברוח", או לזחול או לטפס על הקירות של הצלחת או למטה מתחת התקשורת. מספר תולעים חי בכל יום ניתן להשתמש כדי לקבוע כיצד תולעים רבים ברחו במהלך כל הניסוי. תולעים זה לברוח מוסרים בדרך כלל מהניתוח. כאמת מידה, את אורך החיים הטיפוסי החציוני N2, ג elegans wild-type זן, שמרו על הרג חיידקים-UV ב 20 ° C הוא כ 25 ימים, כפי שהיא נמדדת מן הביצה.

חלק 5: פתרונות

צמיחה נמטודות מדיה (NGM), 100 מ"ל:
שלב:
0.3 גרם NaCl
0.25 גר ' Peptone
2 גרם אגר
החיטוי במשך 40 דקות ולתת להתקרר 55 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף:
100 μL 1 מ 4 MgSO
100 μL 5 מ"ג / מ"ל ​​כולסטרול
100 μL 1 M CaCl2
1.625 מ"ל 1.5 מ KPI-pH 6.0
NGM נוזלי ניתן להשתמש מיד לשפוך צלחות או מותר לחזק ומאוחסנים לטווח ארוך בטמפרטורת החדר
מרק לוריא (LB), 1 ליטר:
10 גרם BactoTryptone
5 גרם תמצית שמרים
10 גרם NaCl
10 מ"ל 1 M טריס pH 8.0
1 ליטר deionized מים
החיטוי ולאחסן בטמפרטורת החדר.
1 M MgSO 4, 300 מ"ל:
73.95 גרם MgSO 4
300 מ"ל deionized מים
החיטוי ולאחסן בטמפרטורת החדר.
5 מ"ג / מ"ל כולסטרול, 200 מ"ל:
1 גרם כולסטרול
200 מ"ל 100% אתנול
סנן לעקר ולאחסן בטמפרטורת החדר.
1 M CaCl 2, 500 מ"ל:
27.75 גרם CaCl 2
500 מ"ל deionized מים
סנן לעקר ולאחסן בטמפרטורת החדר.
1.5 מ KPI pH 6.0, 1 ליטר:
שלב:
31.4 גרם KPI dibasic
179.6 גרם KPI monobasic
850 מ"ל deionized מים
מחממים תוך ערבוב, כדי לאפשר KPI להתמוסס אל תוך פתרון. התאם ל-pH 6.0 עם 10 N NaOH.
מוסיפים מים עד 1 ל deionized
החיטוי ולאחסן בטמפרטורת החדר.
1 M טריס, pH 8.0:
60.57 גרם טריס
400 מ"ל deionized מים
התאם ל-pH 8.0 עם HCl.
מוסיפים מים deionized 500 מ"ל.
סנן לעקר ולאחסן בטמפרטורת החדר.
150 מ"מ Fluorodeoxyuridine (FUDR), 10 מ"ל:
0.3693 גרם FUDR
10 מ"ל deionized מים סטריליים
חנות ב -20 ° C.
100 מ"ג / מ"ל אמפיצילין (AMP), 10 מ"ל:
1 גרם אמפיצילין
10 מ"ל deionized מים סטריליים
חנות ב -20 ° C.
50 מ"ג / מ"ל Carbenicillin (פחמימות), 10 מ"ל:
500 מ"ג Carbenicillin
10 מ"ל deionized מים סטריליים
חנות ב -20 ° C.
1 M איזופרופיל β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG), 10 מ"ל:
2.38 גר ' IPTG
10 מ"ל deionized מים סטריליים
חנות ב -20 ° C.

figure-protocol-1
באיור 1. בשדה תמונות מוארת של C. elegans שלבי החיים, כולל ביצה, ארבעה שלבים הזחל (L1 - L4), וכן למבוגרים. לוחות כל להראות הרמפרודיטים למעט הימנית התחתונה, אשר מראה זכר בוגר (תמונה מתוך ווד (1988)).

figure-protocol-2
איור 2. הנציג נובע ג תוחלת החיים elegans הניסוי השוואת N2 זן פראי סוג למתח המכילה מוטציה בגן daf-2. (א) טבלה המציגה נתונים שנאספו, כולל מספר ימים מאז תולעים היו ביצים, מספר תולעים מת נצפתה בכל יום, ואחוז המדגם המקורי שנותרו בחיים בכל יום (כפי שחושב מן ספירות יומי של תולעים מתות) . (ב) הישרדות עקומות המתאים את תוחלת החיים נתונים שסופקו (A).

"דמות איור 3. השוואה נציג lipofuscin בין הבוגרים ג צעירים ומבוגרים elegans. תמונות שדה מוארת מוצגים על שמאל DAPI תמונות ערוץ הקרינה בצד ימין. לוחות למעלה להראות תולעת בן 4 יום ולוחות התחתונה להראות תולעת בן 11 יום (כפי שנמדד מן הביצה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבקרה הגנטית של אריכות ימים, נחקרה בהרחבה ב C. elegans, בעיקר בשל הקלות ואת המהירות שבה תוחלת החיים ניתן לקבוע. פרוטוקול שנדונו במאמר זה מתאר המסגרת הבסיסית להשגת לשחזור נתונים תוחלת החיים ב C. elegans והוא יכול לחול גם על מינים relatednematode. 2 על ידי ביצוע כמה שינויים פשוטים הליכים אלה ניתן להתאים מדד תוחלת החיים תחת מגוון של תנאים. כאן נדון וריאציות משותף, ובהם חיידקים חיים, התערבות RNA (RNAi), הגבלה תזונתית על ידי מניעת חיידקים ללא שימוש בסמים NG...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי פריצות דרך גלן / מרחוק פרס גרונטולוגיה ו-NIH גרנט 1R01AG031108-01 ל MKGS נתמך על ידי NIH הכשרה מענק P30AG013280. ח"כ הוא רפואי אליסון קרן מלומד חדש הזדקנות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגרמגיבפישר סיינטיפיקDF0145-17-0 (214530)
אמפיציליןמגיבMidSci0339
בקטוטריפטוןמגיבפישר סיינטיפיקDF0123-17-3 (211705)
בקטופפטוןמגיבפישר סיינטיפיקDF0118-17-0 (211677)
CaCl2מגיבפישר סיינטיפיקNC9699248 (1332-01)
קרבניציליןמגיבביוטכנולוגיה זהבC0109
כולסטרולמגיבסיגמא-אלדריץ'C75209
פלואורודאוקסיורידין (FUDR)מגיבסיגמא-אלדריץ'F0503
איזופרופיל β-d-תיוגלאקטופיראנוסיד (IPTG)מגיבביוטכנולוגיה זהבI2481C5
KPi Dibasicמגיבפישר סיינטיפיק5087862 (3252-01)
KPi מונוביסקימגיבפישר סיינטיפיק5087861 (3246-01)
MgSO4מגיבפישר סיינטיפיקNC9561800 (2500-01)
NaClמגיבפישר סיינטיפיקS251
טריסמגיבסיגמא-אלדריץ'T1503
תמצית שמריםמגיבפישר סיינטיפיקDF0886-17-0 (288620)

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-16 (1988).
  2. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Dietary restriction by bacterial deprivation increases life span in wild-derived nematodes. Exp Gerontol. 43, 130-135 (2008).
  3. Garigan, D. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, 1101-1112 (2002).
  4. Chen, D., Pan, K. Z., Palter, J. E., Kapahi, P. Longevity determined by developmental arrest genes in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 6, 525-523 (2007).
  5. Curran, S. P., Ruvkun, G. Lifespan regulation by evolutionarily conserved genes essential for viability. PLoS Genet. 3, e56-e56 (2007).
  6. Dillin, A. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
  7. Hamilton, B. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).
  8. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genet. 1, 119-128 (2005).
  9. Lee, S. S. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat Genet. 33, 40-48 (2003).
  10. Smith, E. D. Age- and calorie-independent life span extension from dietary restriction by bacterial deprivation in Caenorhabditis elegans. BMC Dev Biol. 8, 49-49 (2008).
  11. Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 91, 67-94 (1979).
  12. Emmons, S. W., Sternberg, P. W. C. ELEGANS II. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (1997).
  13. Lipton, J., Kleemann, G., Ghosh, R., Lints, R., Emmons, S. W. Mate searching in Caenorhabditis elegans: a genetic model for sex drive in a simple invertebrate. J Neurosci. 24, 7427-7434 (2004).
  14. Davis, B. O., Anderson, G. L., Dusenbery, D. B. Total luminescence spectroscopy of fluorescence changes during aging in Caenorhabditis elegans. Biochemistry. 21, 4089-4095 (1982).
  15. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).
  16. Steinkraus, K. A. Dietary restriction suppresses proteotoxicity and enhances longevity by an hsf-1-dependent mechanism in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7, 394-404 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

C elegansAMP FUDRUVL4

מאמרים קשורים