מאמר שיטה

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

10.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/1155

⸱

9 ביולי 2009

 ,  ,  , 
1Department of Zoology, University of British Columbia - UBC

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבחון את ההגירה של ותאי גלייה לתוך העין תסיסנית מתפתחות באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לחיות יחד עם התאים GFP גליה מתויג.

תקציר

ותאי גלייה של חוליות והן חסרי חוליות האורגניזמים חייבים לנדוד לאזורים היעד הסופי כדי ensheath ותמיכה נוירונים הקשורים. למרות ההתקדמות האחרונות נעשה כדי לתאר את ההגירה של תאים חיים גליה באגף גלמי פיתוח (1), מחקרים של

פרוטוקול

חלק 1: טרום הניסוי הגדרת.

  1. שבוע מראש, חבר זבובים ליצור זחל המבטאים GFP בשליטת היזם גליה ספציפי. לצורך ניסוי אנו דמיינו GFP מתוייגים עם רצף לוקליזציה גרעיני לידי ביטוי ותאי גלייה באמצעות קוטביות הפוכה (repo) מקדם (3, 4).
  2. הכנת תלושי לכסות לפחות יום אחד מראש על ידי השריית 18 מ"מ עגול תלושי לכסות במשך 10 דקות ב -1% פולי-L-ליזין פתרון אוויר יבש למשך הלילה.
  3. ביום שלפני הניסוי, לנקות תא Chamlide תרבות מגנטי על ידי השריית הרכיבים לילה אתנול 70%.
  4. ביום הניסוי, להכין מדיום על ידי הוספת תרבות בסרום שור עוברית, פניצילין, סטרפטומיצין פתרון, אינסולין 10 מ"ל של מדיום חרקים שניידר באמצעות הטכניקה aseptic. ריכוזי עובדים הם: 1X העובר שור בסרום; 100U/ml פניצילין, סטרפטומיצין 0.1mg/ml; ו 0.2 מ"ג / מ"ל ​​אינסולין בינוני חרק של שניידר (שונה מ - (5)).
  5. אפשר קאמרית תרבות לייבוש באוויר במנדף תרבית תאים. לשטוף אתנול שיורית מהאולם תרבות ע"י שטיפה בינוני תרבות מוכנים.

חלק 2: Dissection של המתחם תסיסנית העין למוח.

  1. בחר הזחל שלישי instar נדודים מהצד של הבקבוקון זבוב מקום טיפת בינוני תרבות מקורר על צלחת פטרי על קרח למשך מספר דקות. Chilling הזחל מומלץ להאט התכווצויות הגוף peristaltic על מנת להקל על דיסקציה.
  2. מניחים את הזחל צונן בטיפת בינוני תרבות על צלחת מצופה Sylgard תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
  3. תחת המיקרוסקופ לנתיחה, להשתמש זוג מלקחיים דומון בסדר בתקיפות לתפוס את הזחל כשליש הדרך מהקצה האחורי. המתן עד הזחל מוציא ווים פיו מסוף הקדמי. אחוז הפה קרסים עם זוג השני של מלקחיים על הרחבה מלאה. כדי לנתח את הזחל, לאט למשוך את שני זוגות מלקחיים בכיוונים מנוגדים. מתחם עין המוח, יחד עם בלוטות הרוק, גופים שומן, רקמת דמותי, ימשוך מהגוף הזחל. אל תמשוך הפה ווים מהר מדי אחרת הם יקרעו את מורכבות העין למוח.
  4. לחתוך בלוטות הרוק, גופים שומן, דיסקים דמותי באמצעות אולטרה דק במספריים גוזז. שתי האונות של המוח העין דיסקים יצורף חוט העצב הגחון ווים הפה.
  5. מקום 18 מ"מ לכסות להחליק על גבי זכוכית נושאת. השאירו קצה אחד של להחליק את מכסה תלוי מעבר לקצה של השקופית כדי מאוחר יותר להרים את מכסה להחליק. הוסף טיפה של תרבות בינוני על גבי תלוש 18 מ"מ מכסה. מעבירים את מורכבות העין אל המוח בינוני התרבות ידי אחיזה ווים הפה עם מלקחיים. אין להבין את מורכבות העין למוח ישירות עם מלקחיים או רקמת ייפגעו.
  6. בעזרת מספריים לנתיחה בסדר, לקצץ את הפה ווים מתסביך העין למוח וזורקים. הסרת הווים הפה חשוב הדמיה לחיות כמו ווים הפה ימשיך החוזה במדיום תרבות גרימת רקמת לעבור במהלך במיקרוסקופ.
  7. כדי להמחיש הגירה גליה בתוך הדיסק עין דמותי, בזהירות לחתוך את גבעול אופטיים, הרקמה הדקה שמחברת את המוח ואת הדיסק העין להרחיק או להשליך את המוח (ראה איור 1 א). כדי להמחיש גליה בתוך גבעול אופטיים, להשאיר את המוח, גבעול אופטיים, ואת הדיסק עין דמותי שלם (ראה איור 1E).
  8. תרימי את coverslip באמצעות מלקחיים לצייר עיגול מתחת סביב הרקמה של עניין עם סמן קבע. מעגל זה יהיה סיוע באיתור רקמה במיקרוסקופ בחלק 4.

חלק 3: הרכבה הדיסק עין דמותי בתא תרבות מגנטי.

  1. בעזרת מלקחיים, לתפוס את הקצה של coverslip תלוי. מעבירים את coverslip לצלחת התחתון של החדר המגנטי Chamlide מבלי להפריע את הרקמה בתרבות.
  2. מניחים את סיליקון O-Ring על הגוף העיקרי של החדר Chamlide. התקן את הגוף העיקרי על גבי צלחת התחתונה.
  3. לאט לאט להוסיף בינוני תרבות לחדר. אל תוסיף את המדיום תרבות מהר מדי או רקמות של עניין יפריעו. לא לגמרי למלא את התא כדי לאפשר חילוף הגזים בחסות.
  4. במקום לכסות בעדינות בלתי נראה על גבי תא Chamlide.

חלק 4: ויזואליזציה של תאים נודדים גליה דיסק העין.

  1. מניחים את חדר תרבות על הבמה של מיקרוסקופ confocal או פלואורסצנטי. אתר את המדגם באמצעות עיגול על coverslip כהתייחסות על בהגדלה נמוכה.
  2. פוקוס על מדגם באמצעות עדשה 40X. אפשר הרקמה להתיישב על coverslip. צלמו תמונות של הדיסק עין או גבעול אופטיים בכל 10-15min במשך 3-4 שעות. רקמות עשויה להתעוות ולהעביר את המיקוד. מיקוד ידני את הרקמה לפני לכידת תמונה שיקלו ההוא הבעיה.

חלק 5: תוצאות נציג:

בביצוע נכון, פרוטוקול שלנו אפשרה לנו לאסוף סדרה של תמונות של ה-GFP-tagged ותאי גלייה כי היגרו גבעול אופטיים לתוך הדיסק עין דמותי (איור 1 BD). בעוד הדמיה לחיות לתקופה 60 דקות היה די כדי לצפות לשינויים בעמדות של גרעינים גליה בתוך דיסק עין הבר סוג דמותי, גרעינים גלייה מוטציה של הגן הכרחי נדידת תאים גליה נכשלה לחלוטין כדי לצאת גבעול אופטיים (חיצים איור 1 FH).

יש לנו תרבות העין למוח מתחמי לתקופות עוד 240 דקות לפני התבוננות התדרדרות רקמת תרבותי. בעקבות נקודת זמן 240 דקות אנו מתחילים להתבונן בתאי ה-GFP חיובי בינוני התרבות הסובבת תרבותי העין למוח מתחמי (חץ איור 2 ג). ב-GFP בנוסף יהיה לצבור נקודות מפוזר בכל הרקמות מציע פירוט של רקמות שלמות.

figure-protocol-1

איור 1: הדמיה חיה של גרעינים GFP-tagged גליה בסוג בר בפיתוח מערכות ראייה מוטציה.
A, E) תמונות שצולמו באמצעות התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) מיקרוסקופיה של סוג בר תרבותי מוטציה העין דמותי דיסקים (ED). בסוג בטבע, ותאי גלייה נולדים ולהעביר מן גבעול אופטי (OS) לתוך דיסק העין. המוח הוסר כדי להקל על השטחת הדמיה של הדיסק עין דמותי. BD) מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הדיסק עין בר תרבותי סוג דמותי ב (א) על 0, 30, 60 נקודות זמן דקה מגלה GFP-tagged גליה גרעינים נודדים בתוך הדיסק העין.

FH) מיקרוסקופ פלואורסצנטי של המתחם העין למוח מוטנטי (ה) על 0, 30, 60 נקודות זמן דקה מדגים השתהות של גרעינים-GFP tagged גליה בתוך גבעול הראייה (חץ). המוח (BR) הושארה המצורפת גבעול הראייה לאפשר הדמיה של גליה בתוך גבעול.

figure-protocol-2

איור 2: הדמיה חיה של ה-GFP-tagged ממברנות גלייה דיסק עין הבר סוג דמותי. יש לנו תרבות בהצלחה את העין למוח מתחמי עבור 240 דקות תקופות. בתרבית רקמה יותר מ 240 דקות מתחיל להישבר. בינוני התרבות הסובבת את הדיסק עין דמותי (ED), גבעול אופטי (OS) האונה במוח (BR) ב 0 (א) ו - 150 דקות (ב), לעומת 300 דקות זמן נקודה (C), ללא תשלום ה-GFP חיובי תאים, שמסומן על ידי החץ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול זה אנו מתארים תצפית של נדידת תאים גליה לתוך הדיסק עין דמותי חיים באמצעות מיקרוסקופ. בדוגמה שלנו סוג בר (איור 1 לספירה), השתמשנו סמן GFP גרעיני לצפות תנועת התא גליה דיסק העין במשך שעה אחת. בשנת מוטציה של הגן מועמד נדרש נדידת תאים גליה כיום תחת מחקר במעבדה שלנו, צפינו השתהות של גרעיני תאים גליה בתוך גבעול הראייה בתקופה של שעה (איור 1 EH). האסטרטגיה שלנו ניתן להתאים לדמיין פירוט של התנהגות הסלולר מוסדר על ידי הגנים שלנו של עניין. לדוגמה, קרום ממוקד מולקולת ה-GFP, כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

פטריק Cafferty נתמך על ידי מענק דוקטורט מן האגודה לטרשת נפוצה בקנדה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Poly-L-lysineריאגנטSigma-AldrichP8920
מצע Schneider’s לחרקיםריאגנטSigma-AldrichS0146
Penicillin-StreptomycinריאגנטSigma-AldrichP4458
תמיסת Insulin מבלוטת הלבלב של בקרריאגנטSigma-AldrichI0516
תא מגנטי ChamlideכליLive cell InstrumentCM-R-10תא מסוג צלחית 35 mm לכיסוי זכוכית (coverslip) של 18 mm
מספרי חיתוך דקים במיוחדכליFine Science Tools15200-00
פינצטת Dumont #5כליFine Science Tools11251-20
מיקרוסקופ פלואורסצנטימיקרוסקופCarl Zeiss, Inc.ניתן להשתמש בכל מערכת דימוי פלואורסצנטית בעלת המסננים והעירור הדרושים עבור GFP.

מקורות

  1. Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. Glial chain migration requires pioneer cells. J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).
  2. Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. Glial cell migration in the eye disc. J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).
  3. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  4. Sepp, K. J., Auld, V. J. Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster. Genetics. 151, 1093-1101 (1999).
  5. Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
  6. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GFP

מאמרים קשורים