עיבוד פיין Loblolly PtGen2 cDNA microarray

Summary

CDNA microarray PtGen2 פותחה ללימודי ביטוי גנים אורן loblolly, פ ' taeda, כוניפאר ומינים אחרים. כאן, אנו מציגים טרום ופוסט הכלאה הטיפול כביסה טכניקות שיכולות לשמש עם מערך זה להניב יותר עקביות, חפצים מופחת, ועל רקע נמוך.

Abstract

PtGen2 הוא cDNA microarray 26,496 תכונה המכיל מוגבר אורן ESTs loblolly. מערך מיוצר במעבדה שלנו לשימוש על ידי חוקרים לומד ביטוי גנים במינים כוניפאר אורן אחרים. PtGen2 פותחה בעקבות גילוי הגן שלנו מאמצים אורן loblolly, והוא מורכב רצפים מזוהים בעיקר לרקמות השורש, אלא גם מן המחט גזע. ^1,2 PtGen2 נבדק על ידי והכלאה שונים סיי-צבע שכותרתו cDNAs כוניפאר היעד , הן באמצעות מוגבר ולא מוגבר בשיטות תיוג עקיף, נבדק גם עם מספר תנאים הכלאה ושטיפת. וידאו זה מתמקד בטיפול ועיבוד של שקופיות לפני ואחרי הכלאה מראש, כמו גם לאחר הכלאה, בעזרת כמה שינויים הנהלים שפותחו בעבר. ^3,4 כמו כן, בצורת טקסט בלבד, הם הפרוטוקולים המשמשים הדור, תיוג ולנקות של cDNA של היעד, כמו גם מידע על תוכנה המשמשת לעיבוד נתונים במורד הזרם.

PtGen2 מודפס עם חיץ להדפיס קניינית המכילה ריכוזים גבוהים של מלח זה יכול להיות קשה להסיר לחלוטין. השקופיות נשטפים הראשון לפתרון SDS חמים לפני הכלאה מראש. לאחר הכלאה מראש, השקופיות נשטפים במרץ כמה שינויים של מים כדי להשלים את הסרת מלחים הנותרים. LifterSlips ™ מנקים אז וממוקמים על השקופיות ומסומן cDNA נטען בזהירות בדרך של פעולה נימי המספק להפצה גם של המדגם על פני השקופית על microarray, ומקטין את הסיכוי ההתאגדות בועה. הכלאה של מטרות למערך נעשית על 48 מעלות צלזיוס בתנאי לחות גבוהה. לאחר ההכלאה, בסדרה של שוטף רגיל נעשים על 53 מעלות צלזיוס בטמפרטורת החדר במשך פעמים המורחבת. עיבוד PtGen2 שקופיות באמצעות טכניקה זו מפחיתה מלח SDS-derived חפצים נראים לעתים קרובות כאשר מערך מעובד פחות קפדני. והכלאה מטרות הנגזרות מספר מקורות שונים כוניפאר RNA, פרוטוקול זה הניב ממצאים פחות עיבוד, רקע מופחת, ובלבד עקביות טוב יותר בין קבוצות הניסוי שונים של מערכים.

Protocol

(הערה סעיפים 1-4 לא הפגינו וידאו)

הכנת סיי שכותרתו יעד cDNA

להלן פרוטוקול אנו משתמשים לסינתזה cDNA של אורן loblolly RNA סך תיוג עקיף cDNA microarray לפני הכלאות. למרות כמה לא טריוויאלי שינויים נעשו, להלן פרוטוקול דומה לזה במדריך המסופק עם ערכת הדרכה עילי תיוג cDNA העקיפים של Invitrogen.

חלק 1: ראשון סטרנד סינתזה cDNA התגובה

1. מערבבים בקצרה....

Discussion

PtGen2 היא פיתחה לאחרונה, cDNA microarray מותאם אישית נועד לשמש בעיקר על ידי הקהילה אורן loblolly מחקר. תוצאות ראשוניות שנוצר עד כה הראו את מערך להיות כלי חשוב בהערכת תעתיק אירועים המתרחשים בתגובה ללחץ בצורת, כמו גם ניטור השינויים המתרחשים במהלך התפתחות העובר בתוך הימי אורן, Pinus pinaster ^5,6 לנו גם הוכיחו לאחרונה כי PtGen2 עובד היטב הכלאות זנים לחצות באמצעות דגימות שבודדו היעד מגוון רחב של סוגים כוניפאר. ⁵ כפי PtGen2 הופך להיות מנוצל יותר על ידי חו.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מאגר			מאגר טרום הכלאה	5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA
מאגר מאגר				30% פורממיד, 5X SSC, 5X Denhardt' s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA. GF), 0.1% SDS
Wash Solution #1	Buffer			1X SSC, 0.2% SDS, חימום מוקדם ל-43°
תמיסת כביסה C #2	מאגר			0.1X SSC, 0.2% תמיסת כביסה SDS
#3	מאגר			0.1X SSC
איזופרופיל אלכוהול	ריאגנט	סיגמא-אולדריץ'	34959-2.5 ליטר
50 מ"ל צינורות חרוטיים	אחרים	בז BD	352070
15 מ"ל צינורות חרוטיים	אחרים	בז BD	352196	השתמש במכסה זה או דומה המונח בתחתית כל צינור חרוטי של 50 מ"ל במהלך צנטריפוגה
צנצנת		Wheaton	900520
צלחת מכתים & מתלה	אלבומין אחר	של Wheaton	900200
מסרום בקר (BSA)	אחר	Sigma-Aldrich	A-9418
PolyA RNA		Invitrogen	POLYA. GF
SuperScriptTM עקיף cDNA תיוג	ערכת	Invitrogen	L1014-02
טורבו DNase	ערכת	אמביון	AM1907
מערכת
Cy-5 צבע	ריאגנט	GE Healthcare	PA25001
Cy-3 צבע	ריאגנט	GE Healthcare	PA23001
LifterSlips™	אחר	Erie Scientific	25X601
HybChambers	ציוד	GeneMachines	JHYB200003