שיטה פשוטה, זולה, יעילה של הכנת עוברים תסיסנית לניתוח לחיות הדמיה מוצג. פרוטוקול שלנו מספק לחות חילוף הגזים ולא לדחוס את העובר תסיסנית. שיטה זו מתאימה עבור הדמיה GFP מבוססי לחיות עוברים תסיסנית באמצעות מיקרוסקופ stereomicroscope או תרכובת זקוף.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging
במאמר זה
סיכום
תקציר
חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מבוססי timelapse לחיות הדמיה היא טכניקה רבת עוצמה ללימוד תקנה הגנטי של תהליכים דינמיים כגון המורפוגנזה רקמות, תאים תאים הידבקות, או מוות של תאים. עוברים תסיסנית להביע GFP הם צילמו בקלות או באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי או confocal. המטרה של כל פרוטוקול לחיות הדמיה היא למזער השפעות מזיקות כגון התייבשות היפוקסיה. פרוטוקולים קודמים להכנת עוברים תסיסנית לניתוח לחיות הדמיה יש מעורב הצבת עוברים dechorionated בשמן halocarbon ו הרבדה אותם בין halocarbon גז קרום חדיר ו coverslip
פרוטוקול
הכנה
- איסוף עוברים על מיץ ענבים רגיל צלחות אגר 4. זה נוח להשתמש אוטומטית תסיסנית ביצה אספן (Flymax ציוד מדעי בע"מ). שימוש סינכרוני מבוים אוספים העובר יהיה להפחית את מספר dechorionations כי יש לבצע כדי להשיג מספרי נאותה של עוברים בשלב ההתפתחותי הרצוי.
- הכן שקופית dechorionation ידי הצמדת נייר דבק דו צדדית לשקופית מיקרוסקופ; להסיר את הגיבוי מהקלטת.
- הכינו את חדר הדמיה חיים על ידי חיתוך פיסת רקמה להשתלב היטב את החדר. מניחים את הרקמה הב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנו מתארים שיטה חדשה להכנת עוברים תסיסנית לניתוח הדמיה לחיות, שאנו מכנים את פרוטוקול ירידה תלוי. למרבה הצער, לא ניתן להשתמש בפרוטוקול ירידה תלוי אם עובדים עם מיקרוסקופ הפוכה. במקרה זה הטכניקה הרבדה (כפי שתואר לעיל מופשט) יש להשתמש דחיסה של עוברים שרידים דאגה.
בניסויים שבהם צורת התא ואת גודל נמדדים על מנת לחשב את הכוחות הקשורים לתנועת המוךפו"גנטי שהולך, שימוש במיקרוסקופ זקוף פרוטוקול טיפה תלויה היא בגלל דחיסה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
בהכרת תודה אנו מודים תמיכה BHR דרך גרנט דיסקברי וכן כלי מחקר גרנט כלי מן למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC). אנחנו גם מכירים את ה אודה תסיסנית Bloomington המניות המרכז מתן מניות גנטי ששימשו את רצפי למשל לחיות הדמיה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
ציוד סטנדרטי החומרים הדרושים כדי להכין עוברים לחיות הדמיה באמצעות פרוטוקול ירידה תלוי כוללים את הפריטים הבאים: שקופיות מיקרוסקופ, coverslips (22 x 40 מ"מ, מס '2), פעמיים צדדי קלטת, מלקחיים של צורף (דומון סגנון מס' 5 ), שמן halocarbon סדרה 56 סדרה 700 (Halocarbon מוצרים קורפ), סכין או כלי להב חד כתער קצה, נייר, מספריים, מים מזוקקים, הקלטת למטרות כלליות, וכן pipet מתאים ומספק μl 20-40. פרוטוקול הדמיה לחיות גם דורש קאמרית מחוייט הדמיה לחיות. זה הוכן על ידי קיצוץ של 5 מ"מ חושב גיליון פלסטיק פוליקרבונט לממדי שקופיות מיקרוסקופ רגיל (75 X 25 מ"מ) באמצעות הרוטור ליצירת דיכאון עמוק 3mm בשקופית (20 X 55 מ"מ). גישה stereomicroscope (לנתח מיקרוסקופ) ומקור סיבים אופטיים תאורה נדרשת גם.
מקורות
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retracti....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
