מאמר שיטה

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

14.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/1206

⸱

13 במרץ 2009

 ,  , 
1Department of Biology, University of Waterloo

במאמר זה

סיכום

שיטה פשוטה, זולה, יעילה של הכנת עוברים תסיסנית לניתוח לחיות הדמיה מוצג. פרוטוקול שלנו מספק לחות חילוף הגזים ולא לדחוס את העובר תסיסנית. שיטה זו מתאימה עבור הדמיה GFP מבוססי לחיות עוברים תסיסנית באמצעות מיקרוסקופ stereomicroscope או תרכובת זקוף.

תקציר

חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מבוססי timelapse לחיות הדמיה היא טכניקה רבת עוצמה ללימוד תקנה הגנטי של תהליכים דינמיים כגון המורפוגנזה רקמות, תאים תאים הידבקות, או מוות של תאים. עוברים תסיסנית להביע GFP הם צילמו בקלות או באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי או confocal. המטרה של כל פרוטוקול לחיות הדמיה היא למזער השפעות מזיקות כגון התייבשות היפוקסיה. פרוטוקולים קודמים להכנת עוברים תסיסנית לניתוח לחיות הדמיה יש מעורב הצבת עוברים dechorionated בשמן halocarbon ו הרבדה אותם בין halocarbon גז קרום חדיר ו coverslip

פרוטוקול

הכנה

  1. איסוף עוברים על מיץ ענבים רגיל צלחות אגר 4. זה נוח להשתמש אוטומטית תסיסנית ביצה אספן (Flymax ציוד מדעי בע"מ). שימוש סינכרוני מבוים אוספים העובר יהיה להפחית את מספר dechorionations כי יש לבצע כדי להשיג מספרי נאותה של עוברים בשלב ההתפתחותי הרצוי.
  2. הכן שקופית dechorionation ידי הצמדת נייר דבק דו צדדית לשקופית מיקרוסקופ; להסיר את הגיבוי מהקלטת.
  3. הכינו את חדר הדמיה חיים על ידי חיתוך פיסת רקמה להשתלב היטב את החדר. מניחים את הרקמה הבאר רטוב עם מים מזוקקים.
  4. Halocarbon מערבבים שמן (Halocarbon מוצרים קורפ) צמיגות סדרה 700 ו סדרה 56 ביחס של 1:01. התערובת ניתן לאחסן ולהשתמש בהם ללא הגבלת זמן.
  5. מניחים כמה טיפות קטנות של שמן halocarbon על פני השטח של coverslip (22 X 40 מ"מ, מס '2). הנפח לא קריטי אבל צריך להיות בסדר גודל של μl 20-40.

נוהל

  1. בעזרת stereomicroscope, לאסוף עוברים מן מיץ ענבים צלחות אגר או באמצעות זוג מלקחיים של צורף (מס '5) או מברשת צבע יפה מאוד. עוברים נוטים להיצמד זה לזה טיפים של מלקחיים, הם התכנסו בקלות גושים.
  2. בעזרת stereomicroscope, בעדינות להוריד את גושי עוברים שיש להם דבק בקצות מלקחיים על פני השטח של הסרט בשקופית dechorionation.
  3. שוב באמצעות stereomicroscope, בעדינות דחיפה או שבץ עוברי עם הצד של מלקחיים על מנת לפרוץ את סיסית דונגי החיצוני ללא פקיעת הקרום הפנימי vitelline (העובר יתפוצץ אם קרום vitelline מקרע).
  4. לאחר סיסית החיצוני כבר מקרע, להקניט את העובר מן סיסית, העובר dechorionated נוטה לדבוק פני השטח של מלקחיים. תשמרי על עצמך כדי להימנע מלגעת העובר dechorionated לפני השטח של הסרט.
  5. ברגע העובר הוא dechorionated, במהירות ולהעביר אותו עד טיפת הכין בעבר שמן halocarbon על coverslip. מגע קצה של מלקחיים נושאת את העובר dechorionated אל פני השטח של טיפת שמן halocarbon - זו מזיזה את העובר מן מלקחיים לתוך השמן.
  6. אישור העברה של העובר עד טיפת שמן. ניתן לעשות זאת בעין בלתי מזוינת ובלבד שאתה עובד על רקע שחור להשתמש במקור סיבים אופטיים תאורה להגדיר בזווית אלכסונית.
  7. לפני שתנסה dechorionate אחר העובר, לנקות שמן מלקחיים. מלקחיים מצופה בשמן יש לרכוש פחות על פני השטח סיסית, מה שהופך dechorionation קשה יותר.
  8. עוברים Dechorionated הם קליל בשמן halocarbon. באמצעות מלקחיים או מכחול תוך צפייה דרך stereomicroscope, לדחוף את העובר אל החלק התחתון של טיפת שמן ומסדרים אותו למיקום הרצוי.
  9. מהר להפוך את coverslip מעל הבאר של החדר הדמיה לחיות. ודא העוברים נחים נגד coverslip בכיוון הרצוי. בשל הציפה שלהם בשמן, העוברים כעת לצוף על פני השטח התחתון של coverslip. תקן את coverslip לחדר הדמיה לחיות עם הקלטת. לאוורר את החדר על ידי חיתוך חורים הקלטת באזור שבו הקלטת משתרע על פני הפער בין סוף coverslip ואת הקצה של הבאר של החדר הדמיה לחיות.
  10. מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף או stereomicroscope הקרינה כעת ניתן להשתמש לתמונה עוברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מתארים שיטה חדשה להכנת עוברים תסיסנית לניתוח הדמיה לחיות, שאנו מכנים את פרוטוקול ירידה תלוי. למרבה הצער, לא ניתן להשתמש בפרוטוקול ירידה תלוי אם עובדים עם מיקרוסקופ הפוכה. במקרה זה הטכניקה הרבדה (כפי שתואר לעיל מופשט) יש להשתמש דחיסה של עוברים שרידים דאגה.

בניסויים שבהם צורת התא ואת גודל נמדדים על מנת לחשב את הכוחות הקשורים לתנועת המוךפו"גנטי שהולך, שימוש במיקרוסקופ זקוף פרוטוקול טיפה תלויה היא בגלל דחיסה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

בהכרת תודה אנו מודים תמיכה BHR דרך גרנט דיסקברי וכן כלי מחקר גרנט כלי מן למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC). אנחנו גם מכירים את ה אודה תסיסנית Bloomington המניות המרכז מתן מניות גנטי ששימשו את רצפי למשל לחיות הדמיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

ציוד סטנדרטי החומרים הדרושים כדי להכין עוברים לחיות הדמיה באמצעות פרוטוקול ירידה תלוי כוללים את הפריטים הבאים: שקופיות מיקרוסקופ, coverslips (22 x 40 מ"מ, מס '2), פעמיים צדדי קלטת, מלקחיים של צורף (דומון סגנון מס' 5 ), שמן halocarbon סדרה 56 סדרה 700 (Halocarbon מוצרים קורפ), סכין או כלי להב חד כתער קצה, נייר, מספריים, מים מזוקקים, הקלטת למטרות כלליות, וכן pipet מתאים ומספק μl 20-40. פרוטוקול הדמיה לחיות גם דורש קאמרית מחוייט הדמיה לחיות. זה הוכן על ידי קיצוץ של 5 מ"מ חושב גיליון פלסטיק פוליקרבונט לממדי שקופיות מיקרוסקופ רגיל (75 X 25 מ"מ) באמצעות הרוטור ליצירת דיכאון עמוק 3mm בשקופית (20 X 55 מ"מ). גישה stereomicroscope (לנתח מיקרוסקופ) ומקור סיבים אופטיים תאורה נדרשת גם.

מקורות

  1. Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
  2. Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. , 248-2429 (2002).
  3. Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
  4. Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים