מאמר שיטה

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

DOI:

10.3791/1229

⸱

25 במרץ 2009

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. קיבעון

  1. תקן עוברים לילה ב 4 ° C עם paraformaldehyde 4% (PFA) ב-PBS.
  2. הסר לתקן ולשטוף 2 x PBS, 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר (RT).
  3. עוברים dechorionate ידני PBS בצלחת זכוכית דיכאון באמצעות מלקחיים שען. לאחר dechorionation, העוברים מועברים באמצעות אש זכוכית מלוטשת פיפטה פסטר כיוון שהם עלולים לדבוק pipettes פוליפרופילן.
  4. העברת עוברים דרך סדרה של 25%, 50% מתנול 75% PBS במשך 5 דקות כל אחד.
  5. החלפת נוזל עם 100% מתנול, דגירה 5 דקות ולאחר מכן להחליף עם מתנול טריים.
  6. מקום בו עוברים -20 ° C למשך תקופה מינימלית של שעה אחת. (אנחנו בדרך כלל לדגור העוברים בין לילה. רגיל ב הכלאה באתרו יעבוד על עוברי מאוחסן במשך יותר משנה, אבל אנחנו לא בחנו אם ברזולוציה גבוהה של ניאון הכלאה באתרו הוא איבד ידי אחסון ממושך.)
  7. לשטוף עוברים במשך 5 דקות כל אחד 75%, 50% מתנול 25% PBST ב RT. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBST ב RT.
  8. תקן שוב למשך 20 דקות ב PFA 4% PBS ב RT.
  9. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBST ב RT.

הערה לגבי PFA:
אנו מאחסנים PFA 4% aliquots ב -20 º C (ראה טבלה של ריאגנטים). עבור קיבעון הראשוני, אנחנו רק להשתמש PFA שלא הופשר קודם לכן. עבור הקיבועים הבאים, אנו מרבים להשתמש PFA כי הופשר קודם לכן. קיבוע ראשוני נראה קריטי עבור מכתים מוצלחת עם פרוטוקול זה.

2. Proteinase AND POSTFIXATION

  1. תקציר עם proteinase K (5μg/ml ב PBST) בשעה RT במשך 3 עד 12 דקות כדי permeabilize את העוברים. (זמן הדגירה תלוי בגילו של עוברים כמו שלבים צעירים רגישים יותר. זה גם תלוי אצווה של האנזים.) לקבלת עוברים שלב somitogenesis, אנחנו בדרך כלל permeabilize במשך 3-4 דקות. במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו.
  2. לשטוף בקצרה PBST ולשטוף פעם במשך 5 דקות בתוך PBST.
  3. תקן שוב למשך 20 דקות ב PFA 4% PBS ב RT.
  4. לשטוף פעמיים, במשך 5 דקות כל אחד, PBST ב RT.

3. PREHYBRIDIZATION

  1. דגירה עוברים במשך 5 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות ב-HYB.
  2. Prehybridize ב-C º 65 במשך שעה לפחות 1 ב HYB +.

4. הכלאה

  1. הסר את כל אבל 50 μl של preHYB, אך הקפד לשמור את העוברים שקוע לחלוטין.
  2. הוספת 1-2 μl של כל riboprobe (digoxygenin ו והעמסת שכותרתו riboprobes) על ידי עוברי ומערבבים בעדינות מצליף את הצינורית. כמות בדיקה הוא בדרך כלל 1-2μl מ תגובה בדיקה 20μl סינתזה.
  3. בהתחשב בכך והעמסת הוא רגיש לאור, צינורות יש לעטוף בנייר אלומיניום או אחרת חשוף לאור מינימלי מרגע זה והלאה.
  4. דגירה עוברים לילה בשעה 65 º C.

5. בדיקה הסרת

ראוי לציין, כי הפתרונות של חומר ניקוי זה חוסר קדימה נקודה. ביעור של חומר ניקוי מופיעה לעזור התגובות מכתים אך גורם העוברים להיות דביק למדי.

  1. הסר את riboprobe.
  2. לשטוף 2 x 30 דקות ב-C º 65 ב formamide/2xSSC 50%.
  3. שטפו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות ב 2 x SSC.
  4. שטפו במשך 30 דקות 65 מעלות צלזיוס ב 0.2 x SSC.

6. אנטי נוגדנים והעמסת הדגירה

  1. חסום במשך שעה לפחות 1 ב RT ב 500μl של פתרון של חיץ 1x חומצה maleic בתוספת 2% ריאגנט חוסם (ראה טבלה של ריאגנטים).
  2. הוסף את הנוגדן אנטי והעמסת-POD, כפי שסופק על ידי חברת רוש, בדילול 1:500 בפתרון חסימה.
  3. דגירה לילה ב 4 º C. במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו.
  4. שטפי 4 x 20 דקות חיץ 1x חומצה maleic. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBS.

7. זיהוי של בדיקה והעמסת-מדביקים לו תווית של

  1. דגירה 30-60 דקות פתרון ה-TSA והעמסת פלוס. (ספין למטה המצע TSA לפני קבלת פתרון מכתים. עבור התגובה, לדלל מגיב tyramide 1:50 במאגר פרקין אלמר diluent הגברה.) במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו. זמן התגובה צריכה להיקבע באופן אמפירי עבור כל בדיקה. למרבה הצער, התגובה מכתים לא ניתן לנטר חזותית כמו המצע הוא פלורסנט, ואחד יראה פלואורסצנטי ירוק בכל מקום ברחבי התגובה מכתים.
  2. שטפו במשך 10 דקות כל אחד 30%, 50%, 75% ו 100% מתנול ב PBS.
  3. דגירה בתמיסה של 1% H 2 0 2 מתנול במשך 30 דקות כדי להשבית peroxidase הראשון.
  4. שטפי 10 דקות כל אחד 75%, 50% ו - 30% מתנול PBS. לאחר מכן לשטוף פעמיים במשך 10 דקות כל אחד PBS. חשוב שכל נפגשוhanol להסירו.

הערות על הגברה האות TYRAMIDE:
We have been באמצעות פרקין אלמר ערכות ה-TSA. אנו מוצאים כי Alexa-Tyramide מצעים כתם גם באמצעות פרקין אלמר diluent חיץ הגברה, אבל אנחנו לא נחלו הצלחה באמצעות חיץ מכתים מסופק עם ערכות בדיקות Invitrogen / מולקולרית. לבסוף, מצאנו כי Cy5 הקרינה מסולק על ידי טיפול שלאחר מכן מתנול / H 2 O 2 ואילו והעמסת Alexa ו-647 אינם מושפעים. Cy3 עשוי גם להיות מושפע לרעה את הטיפול מתנול / H 2 O 2 כפי שהוא קשור מבנית Cy5. מסיבה זו, Cy3 ו Cy5 תגובות TSA יש להשתמש רק עבור התגובה מכתים השני ניאון כפול פרוטוקול באתרה.

8. אנטי Digoxygenin נוגדן הדגירה

  1. חסום את העוברים שוב במשך שעה לפחות 1 ב RT בתמיסה של חיץ 1x חומצה maleic בתוספת 2% ריאגנט חוסם.
  2. הוסף את הנוגדן אנטי DIG POD כפי שסופק על ידי רוש בדילול 1:1000 ב לעיל חסימת פתרון
  3. דגירה לילה ב 4 º C. במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו.
  4. שטפי 4 x 20 דקות חיץ 1x חומצה maleic. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBS.

9. זיהוי של בדיקה Digoxygenin-מדביקים לו תווית של

  1. דגירה 30-60 דקות TSA פלוס Cy5 פתרון (ספין למטה המצע TSA לפני קבלת פתרון מכתים. עבור התגובה, לדלל מגיב tyramide 1:50 במאגר diluent הגברה) במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו. זמן התגובה צריכה להיקבע באופן אמפירי עבור כל בדיקה.
  2. לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד PBST.

10. PROPIDIUM מכתים יודיד

  1. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל 2 x SSC.
  2. דגירה עוברים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס 50 μl 2 x SSCT עם 10 RNAse μl (ריכוז סופי של 100μg/ml).
  3. לשטוף שש פעמים במשך 3 דקות כל אחד 2 x SSC ב RT.
  4. הכתם עוברים במשך 8 דקות בתמיסה של יודיד propidium 330μg/ml ב 2 x SSC.
  5. לשטוף שש פעמים במשך 3 דקות כל אחד 2 x SSC ב RT.
  6. תקן 20 דקות ב PFA 4% PBS ב RT.
  7. לשטוף פעמיים, במשך 5 דקות כל אחד, PBST ב RT.

11. הרכבה

  1. דגירה עוברים במשך 10 דקות כל אחד 25% גליצרול ו 50% PBST. נקה לילה גליצרול 75% ב 4 º C.
  2. אנחנו מחלקים את העוברים ואת deyolk ושטוח הר אותם בשקופית מיקרוסקופ. החלמון יכול לייצר הקרינה רקע משמעותי. Dissection הרבה יותר קל אחרי העוברים ניקית ovenight ב gylcerol.

פתרונות:

PBST PBS פלוס 0.1% Tween
SSCT SSC פלוס 0.1% Tween
HYB- 50% לפוראמיד
5xSSC
0.1% Tween-20
HYB + HYB-
5mg/ml torula (שמרים) RNA
50μg/ml הפרין 		RNA torula מוכן ידי עיכול K proteinase של רנ"א עם פנול, לאחר מכן, פנול, כלורופורם, ו כלורופורם extraction.The-RNA הוא זירז ו מומס במים DEPC שטופלו.
1 x חיץ חומצה maleic 150mm חומצה maleic, NaCl 100mm (pH 7.5)

figure-protocol-1

באיור 1. תוצאות נציג הר שלם פלורסנט כפול הכלאה באתרה. (AC). תמונות להראות קטע confocal יחיד דרך האזור האחורי של עובר דג הזברה בשלב עשר somite. הנוף הגב עם הקדמי למעלה. מוכתם גרעינים עם יודיד propidium הם בצבע כחול. (א) mRNA deltaC זוהה באמצעות riboprobe digoxygenin שכותרתו ו-TSA Cy5 מגיב. (ב) mRNA עיבד מן הגן her1 זוהה עם riboprobe והעמסת שכותרתו ו-TSA והעמסת מגיב. (ג) תעלות מיזוג ירוק ואדום באופן חד משמעי מזהה אזורים של ביטוי גנים שונים או חופפים של שני גנים. (D, E) פירוט הביטוי her1 הוכחת ברזולוציה גבוהה של הליך זה. לוקליזציה subcellular של mRNA ניתן להבחין בבירור. ראשי חץ להצביע על תא מציג שעתוק פעיל, חשף ידי נקודות של מכתים בגרעין. החצים מצביעים על התא המציג לוקליזציה cytoplasmic של mRNA. (F, G) מכתים פעמיים עבור her1 ו deltaC מגלה התאים לתעתוק שני גנים (חץ לבן), או גן או בנפרד (ראשי חץ אדום וירוק).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המובא כאן עובד היטב עם בדיקות שנותנות איתות חזק נקי לאחר מכתים עבור 30-45 דקות phosphatase בתיווך אלקליין טיפוסי התגובה. לפני ביצוע פלורסנט בפרוטוקול הכלאה באתרו, אנחנו תמיד לבדוק בדיקות שלנו באמצעות פרוטוקול סטנדרטי שאינו ניאון (בתנאי בחומר משלים יחד עם פרוטוקול סינתזה בדיקה). היו לנו פחות הצלחה עם פלורסנט בפרוטוקול הכלאה באתרו כאשר באמצעות בדיקות חלש, אבל זה עשוי להיות אפשרי במקרים מסוימים. יש לנו שילוב בהצלחה ניאון בפרוטוקול הכלאה באתרו עם immunolocalization של β-cate...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להכיר את תרומתם של Dörthe Jülich, ג'ניפר עגול ואנדרו מארה בפיתוח פרוטוקול זה. מחקר תמיכה הניתנים על ידי NICHD, האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן ואת מצעד הפרוטות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת Paraformaldehyde 16%, בדרגת EMElectron Microscopy Sciences15710יש לדלל ל-4% ב-1.33x PBS (ריכוז סופי 1x). יש לאחסן באליקוטים של 2ml ב- –20°C
Proteinase K, recombinant PCR gradeRoche Group03115879001יש להכין תמיסת סטוק בריכוז 20mg/ml במים. יש לאחסן באליקוטים של 1ml ב- –20°C
חומר חסימה (Blocking Reagent)Roche Group11096176001יש להכין תמיסת סטוק בריכוז 10% בבופר חומצה מאליאית 1x. יש לאחסן באליקוטים של 50ml ב- –20°C. יציב לאחר מספר מחזורי הקפאה והפשרה.
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragmentsRoche Group11426346910יש לחלק לאליקוטים ולאחסן ב- -20°C. יש לשמור אליקוט עבודה אחד ב- 4°C.
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragmentsRoche Group11207739910כאמור לעיל.
מערכת TSA Plus FluoresceinPerkinElmer, Inc.NEL741001KTיש להכין כל מבחנה של ריאגנט TSA רק בעת הצורך. יש להמיס ב- 60μl DMSO. יש לאחסן ב- 4°C.
מערכת TSA Plus Cyanine5PerkinElmer, Inc.NEL745001KTכאמור לעיל
מערכת TSA Plus Cyanine3PerkinElmer, Inc.NEL744001KTכאמור לעיל
ערכה TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (כולל HRP-goat-anti-rabbit IgG)Molecular Probes, Life TechnologiesT20926יש להמיס את ריאגנט ה-tyramide ב- 150μl DMSO, לחלק לאליקוטים ולאחסן ב- –20°C.
RNase, DNase freeRoche Group11119915001מסופק כתמיסה בריכוז 500μg/ml
Propidium IodideMolecular Probes, Life TechnologiesP-3566מסופק כתמיסה בריכוז 1mg/ml במים.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
  2. Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
  3. Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
  4. Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
  5. Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Whole Mount In Situ HybridizationmRNARNA

מאמרים קשורים