מאמר שיטה

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

23K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/1229

⸱

25 במרץ 2009

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University

במאמר זה

סיכום

הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.

פרוטוקול

1. קיבעון

  1. תקן עוברים לילה ב 4 ° C עם paraformaldehyde 4% (PFA) ב-PBS.
  2. הסר לתקן ולשטוף 2 x PBS, 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר (RT).
  3. עוברים dechorionate ידני PBS בצלחת זכוכית דיכאון באמצעות מלקחיים שען. לאחר dechorionation, העוברים מועברים באמצעות אש זכוכית מלוטשת פיפטה פסטר כיוון שהם עלולים לדבוק pipettes פוליפרופילן.
  4. העברת עוברים דרך סדרה של 25%, 50% מתנול 75% PBS במשך 5 דקות כל אחד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המובא כאן עובד היטב עם בדיקות שנותנות איתות חזק נקי לאחר מכתים עבור 30-45 דקות phosphatase בתיווך אלקליין טיפוסי התגובה. לפני ביצוע פלורסנט בפרוטוקול הכלאה באתרו, אנחנו תמיד לבדוק בדיקות שלנו באמצעות פרוטוקול סטנדרטי שאינו ניאון (בתנאי בחומר משלים יחד עם פרוטוקול סינתזה בדיקה). היו לנו פחות הצלחה עם פלורסנט בפרוטוקול הכלאה באתרו כאשר באמצעות בדיקות חלש, אבל זה עשוי להיות אפשרי במקרים מסוימים. יש לנו שילוב בהצלחה ניאון בפרוטוקול הכלאה באתרו עם immunolocalization של β-cate.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

ברצוננו להכיר את תרומתם של Dörthe Jülich, ג'ניפר עגול ואנדרו מארה בפיתוח פרוטוקול זה. מחקר תמיכה הניתנים על ידי NICHD, האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן ואת מצעד הפרוטות.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת Paraformaldehyde 16%, בדרגת EMElectron Microscopy Sciences15710יש לדלל ל-4% ב-1.33x PBS (ריכוז סופי 1x). יש לאחסן באליקוטים של 2ml ב- –20°C
Proteinase K, recombinant PCR gradeRoche Group03115879001יש להכין תמיסת סטוק בריכוז 20mg/ml במים. יש לאחסן באליקוטים של 1ml ב- –20°C
חומר חסימה (Blocking Reagent)Roche Group11096176001יש להכין תמיסת סטוק בריכוז 10% בבופר חומצה מאליאית 1x. יש לאחסן באליקוטים של 50ml ב- –20°C. יציב לאחר מספר מחזורי הקפאה והפשרה.
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragmentsRoche Group11426346910יש לחלק לאליקוטים ולאחסן ב- -20°C. יש לשמור אליקוט עבודה אחד ב- 4°C.
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragmentsRoche Group11207739910כאמור לעיל.
מערכת TSA Plus FluoresceinPerkinElmer, Inc.NEL741001KTיש להכין כל מבחנה של ריאגנט TSA רק בעת הצורך. יש להמיס ב- 60μl DMSO. יש לאחסן ב- 4°C.
מערכת TSA Plus Cyanine5PerkinElmer, Inc.NEL745001KTכאמור לעיל
מערכת TSA Plus Cyanine3PerkinElmer, Inc.NEL744001KTכאמור לעיל
ערכה TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (כולל HRP-goat-anti-rabbit IgG)Molecular Probes, Life TechnologiesT20926יש להמיס את ריאגנט ה-tyramide ב- 150μl DMSO, לחלק לאליקוטים ולאחסן ב- –20°C.
RNase, DNase freeRoche Group11119915001מסופק כתמיסה בריכוז 500μg/ml
Propidium IodideMolecular Probes, Life TechnologiesP-3566מסופק כתמיסה בריכוז 1mg/ml במים.

מקורות

  1. Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
  2. Jowett, T.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Whole Mount In Situ HybridizationmRNARNA

מאמרים קשורים