, מבחר microinjection, הדמיה של fluorescently שכותרתו F-אקטין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רבב (FSM).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)
במאמר זה
סיכום
תקציר
בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש של פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM) כדי ללכוד תמונות ברזולוציה גבוהה של אקטין הדינמיקה PtK1 תאים. היתרון הייחודי של FSM היא יכולתו ללכוד את התנועה קינטיקה מחזור (הרכבה / פירוק) של רשת ה-F-אקטין בתוך תאים חיים. טכניקה זו שימושית במיוחד הנובעות מדידות כמותית של ה-F-אקטין הדינמיקה כאשר יחד עם תוכנה ראייה ממוחשבת (qFSM). אנו מתארים את, מבחר microinjection ויזואליזציה של בדיקות אקטין פלואורסצנטי בתאים חיים. חשוב לציין, נהלים דומים החלים חזותי macomolecular מכלולים אחרים. FSM הוכח עבור microtubules, חוטים ביניים מתחמי הידבקות.
פרוטוקול
סעיף 1: קבלת אקטין שכותרתו fluorescently שלך FSM
החומרים הדרושים: מטוהרים אקטין, fluorophore (אלקסה, X-rhodamine מומלץ). G-כליקול, ultracentrifuge
- מרכיב מרכזי לרכישת סרטים FSM טוב מחייב תיוג נכון של אקטין (או חלבונים cytoskeletal אחרים) עם fluorophore על פי בחירתך.
אנו ממליצים להשתמש fluorophores של Alexa (488, 568 אורכי גל) ו-X-rhodamine נגזרים succinimidyl אסתר כי היעד שאריות ליזין חשופים על פני השטח של אקטין. - בע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
גורמים מרכזיים הם קריטיים עבור קבלת בהצלחה רבב תמונות, speckles טוב אבל להתחיל ולסיים עם איכות של אקטין שכותרתו fluorescently שלך. יחס גבוה של תיוג צבען מונומר אקטין, להגדיר סביב 0.4-0.7 תבטיח speckles יופיעו בהיר בדידה, ואילו חלבון הנקרא עצמו צריך להיות מסיסים חינם של אגרגטים. לא פחות חשוב הוא נוהל microinjection. כדי להבטיח הומאוסטזיס תא נורמלי (הישרדות), התאים צריכים להיות מוזרק עם הלחץ זרימה נמוכה, מציגה ריכוז נמוך של חלבון הנקרא. זה דורש מידה מסוימת של מומחיות וניסיון טכני / .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
תודות
הפיתוח של qFSM ממומן על ידי מענק NIH U01 GM06230.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
הזרקת חיץ (IB)
50 mM אשלגן גלוטמט
0.5 מ MgCl2 (נספח א '2)
חנות עד 2 שנים ב -20 ° C
G-כליקול
2 מ"מ טריס ⋅ Cl, pH 8.0 (נספח א '2)
0.2 מ"מ CaCl2 (נספח א '2)
הוסף רק לפני השימוש:
0.2 mM ATP (ראה מתכון mM 100)
0.5 2 mercaptoethanol mM
מקורות
- Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin network....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
