למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

פקטור מצופה צמיחה השמה ביד על explants forebrain הגבי

Growth Factor-Coated Bead Placement on Dorsal Forebrain Explants

וידאו זה מדגים שתי שיטות להכנת והצבת חרוזים, אשר היה מצופה גורם הגדילה, על explants של קליפת המוח המתפתח. חרוזים אלה יכולים לשמש כדי לעורר ביטוי גנים מוגבל מרחבית על פיתוח רקמות עצביות כגון explants forebrain. שיטות ניתנים לשימוש הן Affi-Gel חרוזים חרוזים acryllic הפרין.

פקטור מצופה צמיחה השמה ביד על Explants forebrain הגבי

אלו הם הסוג הראשון של החרוצים שבהם אשתמש. אלו הם חרוזי ג'ל כחולים. הם רכים.לכן, עלי להשתמש בפיפט זכוכית מרוכזת בקצה של פיפט פה כדי להניח את החרו지를 על Xs. הסוג השני של חרוזים שאדגים הם חרוזי Heparin acrylic. אלו הם חרוזים מסוג קשיח, ואני אניח חרוזים אלו על explants של X באמצעות מחט טונגסטן. אלו הם צינורות הנימיות מזכוכית שאמיס תחילה באמצעות מבער בונסן.לאחר מכן אני אמשוך אותם כדי ליצור חוד דק יותר. אני מחזיק את צינור הנימי במרכז הלהבה ומגלגל אותו בזמן שהצינור נמס. אני יכול להרגיש שהוא הופך לרך.אני אגביה אותו מהלהבה ואז אמשוך אותו. אני עומד לחרוץ קו לרוחב צינור הקפילרה באמצעות עט זה עם חוד היהלום, כדי שאוכל לבצע חיתוך ישר ונקי. לאחר מכן, אבצע ליטוש בלהבה לקצוות כדי לנקות אותם.אעביר את הקפילרה דרך הלהבה כדי להחליק את הקצה ולהקטין את הפתח, כך שהיא תוכל ללכוד חרוד במקום שהחרוד יעבור דרך הקפילרה. נקודה חשובה שצריך לשים לב אליה היא שאין להחזיק את צינור הקפילרה בלהבה זמן רב. מדובר למעשה במעבר מהיר מאוד, אחרת הוא ייסגר.בדרך כלל אני מכין כמה כאלו, כיוון שבבנייה של רבים מהם הקצה נסגר על ידי הלהבה. קשה לשלוט בכך, לכן פשוט מכינים מספר יחידות. זוהי דוגמה לאחד שבו הקצה נסגר.זהו דוגמה לפיפט תקין. שפפתי 250 µL של חרוזי agel למבחנה זו מסוג einor, ואני עומד לשטוף אותם חמש פעמים עם 1 mL של PBS כדי להסיר את תמיסת ה-azi שבה הם השרו. אמתן כமூן דקות כדי לאפשר לחרוזים לשקוע, ולאחר מכן אשאב את עודפי ה-PBS ואחזור על הפעולה ארבע פעמים נוספות.החרוצים עדיין לא שקעו לחלוטין, כעת החרוצים שקעו ואני אשאב את ה-PBS העודף ואחזור על פעולה זו ארבע פעמים. ובסיום אוסיף 300 microliters של PBS ואתחיל לעבוד עם החרוצים. זוהי פיפטה רגילה (mouth pipette), אני פשוט אקח את הקפילרה שמשכתי ואדחף אותה פנימה עד לשליש מהגובה.ראשית, מלאו את הפפיטות ב-PBS. בדרך כלל המילוי מתבצע באמצעות פעולת נימיות. כאן מופיע מכסה של צלחת תרבית של 30 מילימטר, ועליו הנחתי טיפה של חרוזים בכחול.ולצדו טיפה קטנה של PBS. ובצלחית זו נמצאות טיפות של 5 µL של תמיסת חלבון. במקרה זה, מדובר ב-B and P four, אך ניתן להשתמש בחלבון לבחירה באמצעות פיפטה ידנית.אני עומד להעביר חרוץ מהמעגל הכחול הזה, לשטוף אותו פעם אחת בטיפת PBS. לאחר מכן, אקח את החרוץ באמצעות פיפטה פיו (mouth pipette) ואניח אותו בטיפה של תמיסת חלבון, ואדגרו אותו בטמפרטורת החדר למשך כשעה או ב-4°C למשך מספר שעות. כפי שניתן לראות, יש כאן מאגר של חרוצים ב-PBS ועלי לבחור חרוצים בגודל המתאים.אם הן קטנות מדי, הן פשוט יעברו דרך פיפטת הפה. הן צריכות פשוט להישאר בקצה. כעת אתם רואים שבחרתי שם מספר חרוצים, שלושה חרוצים גדולים ושלושה חרוצים קטנים.אשתמש בחרוזים הגדולים יותר בניסוי. כעת אעביר חרוז גדול מטיפת ה-PBS אל טיפת תמיסת החלבון. כדי לעשות זאת, אמשוך בעדינות את לשוני לאחור מהפיפטית הפה.זו אינה תנועת שאיבה, אלא פשוט הפעלת לחץ שלילי. לאחר מכן אעביר אותו ואחזיר את הלשון מעל הפיה. ראש הצינור, לא נשיפה, אלא פשוט הוספת לחץ חיובי כדי לדחוף את החרוז החוצה מהקצה.כעת יש לי חמישה חרוצים בטיפת תמיסת החלבון, ואדגיר אותם בטמפרטורה של 4°C למספר שעות, או לחלופין בטמפרטורת החדר למשך חצי שעה עד שעה. זוהי צלחת התרבית המכילה את הממברנה הצפה במדיום יחד עם ה-eggplants שכבר דיסקתי. אשתמש בקצה הפיפטה שלי כדי לשאוב מעט מהמדיום.אני עומד לשטוף את החרוצים בטיפה של מצע פעם אחת בלבד, מיד לפני שאני מניח את החרוץ על משטח ה-X. אלו הן מחטי התונגסטן שבהן אשתמש כדי להרים ולהניח את חרוצי האקריליק. זוהי מחט התונגסטן, והיא נמצאת כעת במחזיק שלה.אלו הן פינצטות איכותיות, בזווית של 45 מעלות. אשתמש במחט טונגסטן בפינצטות כדי להרים חבב מתוך מאגר ה-PBS ולהעביר את החבב לטיפה של תמיסת חלבון.בדומה למה שעשיתי עם חרוזי הג'ל. כמו עם חרוזי הג'ל, שטפתי את חרוזי האקריליים הללו חמש פעמים ב-PBS והעברתי טיפה לצלחת זו. לאחר מכן אשתמש במחט טונגסטן המוחזקת בפינצטה כדי להעביר חרוד לטיפה של חלבון ולהדגיר בדיוק כפי שעשיתי עם חרוזי הג'ל.אם כך, מדובר בהרמה של חרוץ. אני מניח את ידי הימנית בחוזקה על השולחן, ומשתמש באצבע השמאלית כדי לייצב את המחט בזמן הירידה אל הנוזל; אני נוגע קלות בחרוץ בעזרת המחט ומרימ אותו באיטיות מהנוזל. לעיתים הוא נופל מהמחט, ובמקרה כזה פשוט חוזרים כדי להרים חרוץ אחר.כעת, בידי השמאלית, אחזיק בפינצטה בזווית של 45 מעלות. כאשר הקצוות פונים כלפי מטה, אגע בחרוז ובמחט בנוזל. אשתמש בקצה הפינצטה כדי ללחוץ עליהם בעדינות כדי לשחררם.כעת יש לי חמש חרוזי חלבון. בסדר, ביד ימין אני מחזיק את מחט הטונגסטן בתוך החרוד, וביד שמאל את הפינצטה שוב עם הקצה כלפי מטה, באותה דרך שבה דחפתי אותם מהארבעה, אעשה זאת שוב כאן על ה-x explan. יש להדגיר ב-37 °C והזמן תלוי במבחן הספציפי.

growth-factor-coated-bead-placement-on-dorsal-forebrain-explants

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

University of California, Irvine (UCI).  וידאו זה מדגים שתי שיטות להכנת והצבת חרוזים, אשר היה מצופה גורם הגדילה, על explants של קליפת המוח המתפתח. חרוזים אלה יכולים לשמש כדי לעורר ביטוי גנים מוגבל מרחבית על פיתוח רקמות עצביות כגון explants forebrain. שיטות ניתנים לשימוש הן Affi-Gel חרוזים חרוזים acryllic הפרין.

פקטור מצופה צמיחה השמה ביד על Explants forebrain הגבי

במאמר זה

סיכום

גילויים

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות