למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

dissection של דיסקים דמותי מן הזחלים 3 תסיסנית instar

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

פרוטוקול זה מדגים את הטכניקה לנתיחה משמש לבידוד דיסקים דמותי מן הזחלים תסיסנית בשלב instar 3. שיטות לתיקון רקמות אחרי אומר והסרה של הזרוע, רגל, עין ודיסקים הם הוכיחו ישירות על שקופיות מיקרוסקופ להדמיה הבאים.

Dissection של דיסקים דמותי מן הזחלים 3 תסיסנית Instar

היום אני אראה לכם כיצד לבצע דיסקציה של דיסקים דמיוניים (imaginal discs) מz larvae של דרוזופילה בשלב השלב השלישי (third instar). ניתן להשתמש בדיסקים של זחלי שלב שלישי למספר תהליכי התפתחות. במעבדה שלנו אנו בוחנים אותם כדי לצפות בתהליך של אפופטוזיס, אך ניתן לבטא בהם חלבונים שונים וללמוד אותם בדרך זו, ולראות כל מיני תהליכי התפתחות המתרחשים בתוך הדיסקים לפי הסדר.כדי לעשות זאת, אשתמש במספר כלים חשובים מאוד. ראשית, מקל הברירה (picking stick) שבאמצעותו נוציא את הלרוות מהצלחות שלהן. לאחר מכן, וזה חשוב מאוד, פינצטת דיסקציה, שחייבת להיות חדה במיוחד כדי שניתן יהיה להמשיך בתהליך הדיסקציה.לאחר מכן נשתמש בלהב ניתוח, להב ניתוח מספר 11, כדי להוציא את הדיסקים מהראש. לאחר מכן נניח את הדיסקים על תבנית זכוכית עם vector shield כחומר קיבוע. לכן, הדבר הראשון שנעשה הוא לאסוף מספר זחלי third and star wandering.אני פשוט משתמש במקל הברירה שלי כדי למעשה להדליק אותם מדופן המבחנה. לעיתים זה עוזר אם המקל מעט רטוב, ואז מעבירים אותם לטיפה של PBS. אוקיי, כאן יש לנו את הלרבות השלישית שלנו.מכיוון שאני ימני, אני אסובב את ראשו לכיוון ימין, ונשתמש במספר נקודות ייחוס כדי להנחות אותנו היכן לאחוז בו. הראשונה היא החלק המרכזי של ה-trachea כאן וכאן. ולאחר מכן ישנו חתך רוחבי קטן כאן למעלה, לכיוון הראש.ראשית, אני אחזיק בעדינות את הזחלים בערך בשני שלישים מגוף הזחל, במרחק מהראש. לאחר מכן, אחזיק ביד ימיני מספר מילימטרים מאחורי רכיב החיבור (cross piece), תוך ניסיון להגיע למחצית רוחב הזחל. כך מתקבלת אחיזה טובה למדי.ניתן לראות שהגעתי בערך לחצי הדרך. כעת אני אמשיך למשוך בעדינות קדימה עם ידי ימני, ראו את כל המעיים שיוצאים שם. אוקיי. כעת ניתן להשליך את החלק העיקרי של הגוף.וכאן יש לנו את הראש, הכולל את הדיסקים האימגינליים המחוברים לחלקי הפה. לכן, אני אתפוס אותו בחלקי הפה כדי שלא אמעך אף אחד מהדיסקים ואעביר אותו לטיפה רעננה של PBS. כעת יש לנו את ראש הזחל המקובע.נסיר את כל עודפי הרקמה ונאחז בזחל באמצעות חלקי הפה כפי שנעשה קודם לכן, או שניתן להצמיד אותו לפלטת הנתיחה בעזרת הפינצטה. חלקי הפה נמצאים כעת מצד שמאל. ובכן, כאן אנו רואים את מערכת העיכול, שאיננו מעוניינים בה, וכאן יש בלוטה רוקת.ישנן רקמות שומן או גופי שומן. המשיכו להסיר אותם, במיוחד את השומן, שעלול להפריע לחלק מהבדיקות ולצביעה של דברים שאינכם רוצים. כעת יש לנו את ראש הזחל הנקי.כעת יש בידינו את ראשי הזחלים, אשר נשלו מהגוף, קובעו ונשטפו, הרקמות העודפות הוסרו, והם טופלו בכל טיפול הנדרש, כגון צביעת נוגדנים ב-C two tunnel או צביעה תפקודית אחרת. כעת הנחנו אותם על זכוכית ומסומנים לביצוע השליפה של הדיסקים עצמם מהראש, מאזורי חלקי הפה.בסדר, הפעם חלקי הפה שלנו נמצאים כאן משמאל. אני אקח את הפינצטה שלי ואפשוט אלחץ אותה מטה כנגד הזכוכית. ביד ימין יש לי להב סקלפל מספר 11, שהוא כלי עדין יותר, שבאמצעותו אבצע את הניתוח.ראשית, אני אסיר את ה-CNS ואת האונות האופטיות. ניתן לראות את ה-CNS, את שתי האונות האופטיות, ואת דיסקיות העין והמחוש (eye antenna discs) המחוברות אליהן. לכן, אני מסיר את ה-CNS על ידי החדרת הלהב בין האונות האופטיות לבין דיסקיות העין ומשיכה איטית, כך שדיסקיות העין נמתחות החוצה.בסדר, שם אנו רואים את ה-CNS ואת האונות האופטיות. כעת יש לנו את שתי דיסקיות העין, שהופרדו מה-CNS. עכשיו אני אסיר אותן מחלקי הפה באמצעות חיתוך עדין ומשיכה בבסיס.ובכן, ישנה דיסקית עין-תחושה אחת, והדיסקית השנייה. ובכן. ועכשיו ניתן לראות את דיסקית הכנף בולטת כאן. אני אנסה, שוב, למצוא בעדינות את הבסיס, לחתוך ולמשוך.כך שקיבלנו דיסק כנף ודיסק רגל המחוברים אליו, יחד עם מעט קנה נשימה (trachea). אוקיי, אז זהו דיסק הכנף שלכם עם דיסק רגל מחובר, וכמובן שישנם מספר דיסקי רגליים. לכן, אנחנו יכולים לחפש כאן ולמצוא דיסקים נוספים פשוט על ידי מישוש עדין עם הלהב.אלו כל הדיסקים שנמצא במקרה זה. ישנם עוד מספר דיסקי רגליים.

dissection-of-imaginal-discs-from-3rd-instar-drosophila-larvae

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

University of California, Irvine (UCI).  פרוטוקול זה מדגים את הטכניקה לנתיחה משמש לבידוד דיסקים דמותי מן הזחלים תסיסנית בשלב instar 3. שיטות לתיקון רקמות אחרי אומר והסרה של הזרוע, רגל, עין ודיסקים הם הוכיחו ישירות על שקופיות מיקרוסקופ להדמיה הבאים.

Dissection של דיסקים דמותי מן הזחלים 3 תסיסנית Instar

במאמר זה

סיכום

גילויים

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות