אנו מציגים במבחנה, שני צבעים assay הקרינה לדמיין את היתוך של חלקיקי נגיף יחיד עם bilayer היעד נוזל. על ידי תיוג חלקיקים נגיפיים עם fluorophores כי דיפרנציאלי כתם הממברנה ויראלי הפנים שלה, אנו יכולים לפקח על קינטיקה של hemifusion היווצרות נקבוביות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד
במאמר זה
סיכום
תקציר
היתוך ממברנה היא מהווה נדבך חיוני במהלך כניסה של וירוסים עטופים לתוך התאים. מבחני היתוך קונבנציונלי בדרך כלל לדווח על מספר רב של אירועים היתוך, ולכן קשה לנתח באופן כמותי את רצף הפעולות המולקולריים המעורבים. פיתחנו במבחנה, שני צבעים assay הקרינה לפקח קינטיקה של פיוזינג חלקיקי נגיף יחיד עם bilayer היעד על תמיכה נוזל בעיקרו.
חלקיקים שפעת נגיפית מודגרת עם fluorophore lipophilic ירוק להכתים את הממברנה fluorophore הידרופילי אדום להכתים את פנים ויראלי. אנו פיקדון bilayer ganglioside המכילים שומנים על פני השטח dextran-functionilized הזכוכית של התא זרימה, דגירה חלקיקים נגיפיים על bilayer את התמונה מישוריים את הקרינה של 100 x 100 מיקרומטר אזור 2, המכיל כמה מאות של חלקיקים, על CCD המצלמה. על ידי הדמיה הן פלואורסצנטי אדום וירוק, אנחנו יכולים בו זמנית לפקח על התנהגותם של לצבוע את הממברנה (ירוק) לבין תוכן מימית (אדום) של חלקיקים.
לאחר הפחתת ה-pH מתחת לערך pH המיזוג, חלקיקים יהיה הפתיל עם הממברנה. Hemifusion, מיזוג של עלון החיצוני של קרום ויראלי עם עלון החיצוני של קרום היעד, יהיה גלוי כשינוי פתאומי פלואורסצנטי ירוק של חלקיק. עם היתוך הבאים של שני כרוזים דיסטלי הנותרים נקבוביות תוקם ואת fluorophore אדום פולטות חלקיק נגיפי ישוחררו תחת קרום היעד. אירוע זה יהיה להצמיח ירידה של הקרינה האדום של חלקיקים בודדים. לבסוף, פלואורסצנציה משולב מ fluorophore pH רגיש המוטבע קרום היעד מדווחת על הזמן המדויק של ירידה ה-pH.
מתוך שלושת זמן פלואורסצנציה-עקבות, את כל האירועים החשובים (ירידה pH, שומנים ערבוב על תוכן hemifusion, ערבוב על היווצרות נקבוביות) כעת ניתן לחלץ בצורה ישירה עבור כל חלקיק בנפרד. על ידי איסוף פעמים שחלף על מעברים שונים עבור חלקיקים בודדים רבים היסטוגרמות, אנו יכולים לקבוע את תקופות חיים של ביניים המקביל. אפילו ביניים נסתרים אין הנצפה פלורסנט ישיר ניתן דמיינו ישירות היסטוגרמות אלו.
פרוטוקול
להחליק זכוכית לכסות functionalization
Bilayer מישוריים המשמשים assay היתוך נתמך על סרט hydrated של dextran. Dextran מעשים כשומר רווח בין bilayer מישוריים משטח זכוכית. זה מונע מרכיבי קרום מלהיות תקוע על משטח זכוכית מספק גם מקום שבו התוכן של חלקיק וירוס יכול להימלט על היתוך. Coverslips זכוכית הן פונקציונליות דרך הטיפול עם אפוקסי silane, אשר מאפשר לנו כימית האג"ח dextran על זכוכית (Elender, et al. 1996).
- סדר coverslips 25 מ"מ במעמד מכתים קרמיקה, והמקום מתלה לתוך צנ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הכנת נוזל רציפה bilayers השומנים נתמך יכול להיות מאתגר. כמויות זעירות של חומר מזהם פגמים או משטח תמנע הפצת bilayers. בתצהיר ניקוי זהיר של שכבה אחידה של dextran חיוניים.
הדמיה ממושכת של חלקיקי הנגיף יכול להלבין את תוויות ניאון או לגרום להם להיות מובטל. Photo-נזק מסוג זה ידוע היטב ביו הדמיה שדות מולקולה בודדת הוא האמין בדרך כלל נובעות הדור של מינים החמצן מגיב על ידי fluorophores נרגש. כדי למזער את הנזק צילום, אנחנו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
העבודה נתמכה על ידי NIH מענקים AI57159 (עד SCH) ו AI72346 (עד AMvO). SCH הוא הווארד יוז חוקר רפואי במכון.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ריבועי זכוכית כיסוי של Corning, 25 מ"מ | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| שקופיות סיליקה מותכת | זכוכית טכנית | ||
| מתקן צביעה | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3-גליסידוקסיפרופיל)טרימתוקסיסילאן | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-די-אולאאוליל-<מיקרוסקופיה אלקטרונית בשימור (EM)>נא לספק את הטקסט המקור לתרגום.-גליסרו-3-פוספוכולין (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-פאלמיטויל-2-אולאאויל-<מיקרוסקופיה אלקטרונית* (Electron Microscopy) או פליטה אלקטרומגנטית, בהתאם להקשר המדעי.>סנ׳ (sn)1-פאלמיטויל-2-אולאיל-גליצרו-3-פוספוכולין (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| כולסטרול | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| <מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM)>N-((6-(ביוטינויל)אמינו)הקסנויל)-1,2-דיהקסדקנויל-<מיקרוסקופיה אלקטרונית בשימור (EM)>נראה כי השארת את ההודעה ריקה או ששלחת רק את האותיות "sn". אנא ספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם, ואשמח לבצע את התרגום המקצועי לעברית בהתאם להנחיות שקיבלתי.גליסרו-3-פוספו–תנולאמין, מלח טריאתילאמוניום (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| סטראפטידין, צמוד פלואורסצאין | Invitrogen | S-869 | |
| דיסיהלוגנגליוזיד GD1א ממוח בקר | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| מיני-אקסטרודר | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| מסנני קמימות פוליקרבונט בנקבוביות של 0.1 מיקרון | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| דיסקי ניקוז בקוטר 10 מ"מ (תמיכות ממбраנה) | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| מלח נתרק של סולפורודמין b | S1402 | ||
| אוקטדציל רודמין 110 (Rh110C18) | <מיקרוסקופיה אלקטרונית בשימור (EM)>ראה פלויד <מיקרוסקופ אלקטרוני (EM)>ואחרים. 2008 עבור פרוטוקול סינתזה | ||
| עמודי הסרת מלחים PD-10 | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנציה של Nikon | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| עדשה אובייקטיבית Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA | Nikon Instruments | ||
| לייזר Ar/Kr מדגם Innova 70C Spectrum | Coherent Inc. | ||
| משאבת מזרק | Harvard Apparatus | 702213 |
מקורות
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
