היכולת של תאים עובריים נבטי להתמיין לתאי נבטי קדמוני בשלבי הפיתוח המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 ימים coitum עוברים לפרסם העכבר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
היכולת של תאים עובריים נבטי (למשל) כדי להתמיין לתאי נבטי קדמוני (PGCs) ומאוחר יותר לתוך הגמטות במהלך שלבי ההתפתחות המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 בימים שלאחר coitum (DPC) עוברי עכברים. פיתוח רכסים האשכים מעוברים העכבר (C57BL6J) היו מנותקים על ידי הפרעה מכנית עם collagenase, אז מצופה שכבה העובר עכבר מזין פיברובלסטים (MEF-CF1) כי היה בעבר מומת mitotically בנוכחות התקשורת בנוקאאוט עם mitomycin C שיושלם עם מעכבי לוקמיה פקטור (LIF), פיברובלסטים בסיסי גורם הגדילה (bFGF), וכן גורם לתאי גזע (SCF). שימוש בשיטות אלה אופטימיזציה עבור זיהוי ובידוד PCG, והקמת התנאים תרבות היתרי תרבויות ארוך טווח של תאים EG במשך יותר מ 40 ימים. הקווים עובריים נבטי הראו פנוטיפ הביטוי עובריים של סמנים בשימוש משותף של המדינה pluripotent. בידוד הגזירה של תאים נבטי בתרבות לספק כלי להבין את התפתחותם במבחנה מציעים את ההזדמנות כדי לפקח על נזק מצטבר ברמות גנטיים epigenetic לאחר חשיפה סטרס חמצוני.
פרוטוקול
חלק 1: laparotomy עכבר בהריון
- שימוש נקע בצוואר הרחם, להרדים עכבר בהריון C57BL6J נקבה ב 10.5-11.5 DPC.
- נקו את הבטן עם סבון מיקרוביאלית, ולאחר מכן, לגלח אותו.
- לאחר גילוח, לשטוף את הבטן עם מלוחים פתרון.
- לאחר מכן, לייבש את הבטן עם גזה סטרילית.
- מכסים את העכבר עם שדה סטרילית חדשה.
- ביצוע חתך הגחון בא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
מחקר זה נערך לאחר בדיקה וטיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש הוועדה (IACUC) אישור פרוטוקול העכבר שלנו # 08030 (תפקיד החמצן מגיב Species-ROS בפיתוח קו נבט היווצרות הגידול: החזקת וגידול פרוטוקול) בשעה מיסיסיפי סטייט.
תודות
המחברים רוצים להכיר לעזור יסולא בפז של: ד"ר ניל הראשונה Kourtney וילקינסון עבור עריכת כתב היד, ד"ר לוסי Senter, ד"ר Brigit Willeford ומייק Basett לסיוע בטיפול הדרכה חיה במתקן ALAC MSU העכבר מוכר; ד"ר דוויין וייז עבור עזרתו עם מיקרוסקופיה לכידת תמונה: סזאר מונרוי, חנה Swoope, ובובי Huddleston על עזרתם עם ייצור וידאו MSU. מחקר זה מומן על ידי משרד המחקר המוסדיים ואת המחלקה למדעי הביולוגיה על מיסיסיפי סטייט.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
מלקחיים מס '14 ו -15, 35 מ"מ אזמל, מספריים לנתיחה, שדות כירורגית, סבון מיקרוביאלית, תמיסת מלח 0.9%, גזה, קצף מיכל קרח, סכין גילוח, 35 מ"מ אזמל, מלקחיים קנס מס' 4 ו - 5, מחט מתגרה בסדר לטפל, לסנן גיליונות נייר, ומשכה pipettes זכוכית.
ציוד: stereomicroscope לנתח, אור מקור שוט Fostec, מיקרוסקופ הפוכה, micropipette 10 ו 200ul, צנטריפוגות, הקבינט ביו בטיחות.
ציוד: stereomicroscope לנתח, אור מקור שוט Fostec, מיקרוסקופ הפוכה, micropipette 10 ו 200ul, צנטריפוגות, הקבינט ביו בטיחות.
מקורות
- DeFelici, M. Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, Second Edition, 73-85 (1998).
- Donovan, P. J., De Miguel, M. P. Turning Germ Cells into Stem Cells. Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).
- Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
