כאן אנחנו מראים איך לעשות רטרו מסלולית הזרקת דג הזברה מבוגר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
טיפול תרופתי של בעלי חיים שלמים היא כלי חיוני בכל מערכת מודל מחקרים גנטיים תרופתי כימי. תוך ורידי (IV) הזרקה היא לעתים קרובות בצורה היעילה ביותר פולשנית המסירה של סוכן של עניין. בשנת דג הזברה (
פרוטוקול
חלק 1. הכנת חומר הזרקה
- Tg (גלובין: GFP) בתאים:
- Bleed דגים התורם מבוגר באמצעות קצה פיפטה 10ul מצופה הפרין (1unit/ul) לדגים לנקב מאחורי הזימים.
- לשאוב כדוריות דם אדומות לוותר במאגר תא (PBS 0.9X + 5% FBS + פן 1% / סטרפטוקוקוס).
- תא ההשעיה סנן על רשת 40uM ולקבוע ריכוז של תאים באמצעות hemocytometer כפי שתואר לעיל על ידי LeBlanc et al.
- ספין למטה resuspend במאגר תא בריכוז הרצוי כזה נפח הזריקה האחרונה היא לא יותר מאשר 5ul. כאן אנו מזריקים תאים 1.5-2000000 / נמען.
- עבור, dextran טקסס האדום ®, לפזר את הצבע DPBS ריכוז זריקת הסופי של 10-12 מ"ג / מ"ל. תוכנית להזרים 4 UL לכל הדגים.
חלק 2. הזרקה
- הרדימי דגים tricaine (4.2ml (4mg/ml) מים tricaine/100ml דגים).
- לשטוף המילטון מזרק 3-4 פעמים לפני הזריקה באמצעות אתנול 70%. יש לשטוף 3-4 פעמים עם DPBS 0.9X.
- מקום דגים בצד הגבי מעלה מול ימין על ספוג לח.
- החזק את המזרק המילטון עם יד ימין שלך עם האצבע המורה על הבוכנה. בעדינות לייצב את הגוף של הדג ביד שמאל.
- מקמו את המחט עם שפוע פונה כלפי מעלה כך שאם העין של הדג היו שעון, המחט תהיה הצבעה במיקום 7:00 ו בזווית של 45 מעלות דגים (איור 1).
- הכנס בעדינות מחט 1-2 מ"מ למצב 7:00 ולאט לאט לוחץ על המתג.
- אפשר לשחזר את הדגים במים E3 טריים.
- לשטוף מחט, כמתואר לעיל, בין זריקות של חומרים כימיים שונים.
- תא Flick פתרון resuspend התאים כל כמה דקות כדי למנוע clumping התא.
- שמור על הדגים את זרימת שבוע 1 עם שינויים מים בכל יום, כדי למנוע זיהום. אנחנו שומרים דג במים לטיפול נמרץ למשך תקופה זו (מעיל 10ml מתח + pemafix 5 מ"ל + melafix 5 מ"ל לכל 38 ליטר מים E3).
חלק 3. נציג תוצאות
כאשר ביצעו כראוי, אפשר לדמיין החומר מוזרק אם זה כבר מסומן בדרך כלשהי. לדוגמה, Tg (גלובין: GFP) כדוריות הדם האדומות יש לראות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתיחה במחזור vasculature של דגים קספר הנמען זמן קצר לאחר ההזרקה כפי שמוצג באיור 2. כמו כן, הזרקת dextran 70kDa, מצומדות לטקסס האדום ® ניתן דמיינו vasculature של דג שקוף מיד לאחר ההזרקה רטרו מסלולית (איור 3). תאים כליה מן פלורסנט (β-אקטין: GFP) Tg דגים התורם יכול גם להיות מוזרק רטרו orbitally לתוך הדג קספר מוקרן הנמען. תאים אלה בסופו של דבר הביתה מח הנמען (תמונה 4 א) והוא רשאי מכן להמשיך לאכלס מחדש את כליה לאחר מספר שבועות (איור 4 ב).
אם הזריקה הוא רדוד מדי או את הזווית של המחט עוקף את רטרו מסלולית סינוס חלל ורידי, החומר המוזרק עלול להיות דמיינו מתאגדים סביב העין או זורם החוצה. לחילופין, אם הזריקה הוא עמוק מדי, דגים עשויים לחוות נזק לרקמות או דימום מוגזם, למרות שהם עדיין יכולים להתאושש. כאשר ביצעו כראוי, התמותה לאחר ההזרקה רטרו מסלולית צריך להיות פחות מ 5% דגים מוזרק הכולל ההצלחה של משלוח הדם צריך להיות גדול מ 90% של דגים מוזרק מוחלט.
איור 1: איור של טכניקה רטרו מסלולית ההזרקה. העין הימנית של הדג מיוצג שעון אנלוגי שבו עמדה 7:00 המתאים במקום הזרקה נכונה.
איור 2: Tg (גלובין: GFP) כדוריות הדם האדומות במחזור vasculature הזנב של דג קספר מבוגר שלושה ימים לאחר ההזרקה רטרו מסלולית.
איור 3: זריקה מוצלחת של dextran 70kDa מצומדות לטקסס האדום ® משמש לצבוע מייצרת vasculature ניאון הדגים הבוגרים שקוף, קספר והוא מוצג בקלות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תקן שלם של בעלי חיים.
תרשים 4 א: שלושה ימים לאחר הזרקת רטרו ההקפה של כל התאים במח כליה מן (β-אקטין: GFP) Tg דגים התורם, התאים ניתן דמיינו ביות עד לשד הכליה של קספר מוקרן דגים בוגרים הנמען.
דמות4b: ארבעה שבועות לאחר ההזרקה רטרו ההקפה של כל התאים במח כליה מן (β-אקטין: GFP) Tg דגים התורם, ואכלוס של הכליה הנמען ירוק עם כל תורם כליה תאים במח ניתן דמיינו ב קספר מוקרן דגים בוגרים הנמען.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
רטרו מסלולית הזרקת דג הזברה מבוגר נותן את היעילות הגבוהה ביותר של מסירת החומר מוזרק לזרם הדם עם השכיחות הנמוכה ביותר של תמותה. בשל אופיו של המקום הזרקה, לנקב מופיע לרפא במהירות, להקטין את המופע של זיהום כמות איבוד הדם. האתר עשוי אפילו להיות מוזרק שוב ושוב במהלך פרק זמן קצר עבור זריקות יומיות של תרופות, למשל.
כמויות גדולות של סמים יש לרכוש עבור שיטות טיפול מסורתיות דגים בוגרים אשר הדגים שקועים פשוט ספוגה במים המכי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי הווארד יוז רפואי מכון מענק מ-NIH לחקר hematopoiesis עובריים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מלח נתרני של הפרין מרירית מעי של חזיר | Sigma-Aldrich | 2106 | בקבוקון ששוקל מראש 300 יחידות USP |
| Tricaine-S | Western Chemical | MS-222 | |
| Dulbecco’סלויין פוספט (Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 14190-144 | |
| דקסטראן, Texas Red® | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl22 0.33 mM MgSO42 | ||
| מזרק מיקרוליטר | Hamilton Co | 80300 | 701N 10uL SYR (26s/2”/2) |
מקורות
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
