Dextran נתרן סולפט (DSS) מנוהל במי השתייה הוא מודל הוקמה Murine פגיעה דלקתית חריפה של קוליטיס. פרוטוקול זה מתאר את שיטת הטיפול DSS והכנת רקמות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קוליטיס דוגמנות Murine באמצעות נתרן dextran סולפט (DSS)
במאמר זה
סיכום
תקציר
קוליטיס יכולה להתרחש מפני זיהומים נגיפי או חיידקי, להעליב איסכמי, או הפרעות אוטואימוניות, קוליטיס כיבית ביותר בעיקר את גרסה הגס של מחלת קרוהן - קוליטיס קרוהן. קוליטיס חריפה עשויה להציג עם הכאב התנפחות הבטן, ספיגה, שלשולים, hematochezia וריר בצואה. אנו מתחילים להבין את יחסי הגומלין המורכבים בין הסביבה, גנטיקה, תפקוד מחסום האפיתל דלקתיות מחלות מעי חיה מודלים של קוליטיס כבר חיוני בקידום ההבנה שלנו של מחלה זו. אחת מודל פופולרי כרוך להשלים את מי השתייה של העכברים עם סולפט dextran משקל מולקולרי נמוך נתרן (DSS), וכתוצאה מכך לנזק אפיתל תגובה דלקתית חזקה במעי הגס שנמשכה כמה ימים
פרוטוקול
חלק 1: פציעה, תיקון דגם קוליטיס
- משקל Baseline יש לקבל עבור כל עכבר לפני תחילת הטיפול DSS.
- בצע 3% (w / v) נתרן סולפט dextran מלח פתרון במים ולסנן עם מסנן 0.45 מיקרומטר אצטט תאית.
- החלף מי שתייה בכלוב עכבר עם פתרון DSS 3% במשך ארבעה ימים. העכברים לא צריכה להיות גישה לכל מקור מים אחר (טיפים הדרה כלומר דגש על מערכות השקיה אוטומטיות).
- ביום הרביעי, להחליף את פתרון DSS עם מים במשך שלושה ימים נוספים, ומאפשר התאוששות אפיתל המעי הגס. העכברים צריכים להישקל על ארבעה ימים על מנת לכמת את ההשלכות המערכתיות של קוליטיס. ירידה במשקל היא נפוצה עם פגיעה חמורה.
- ביום 7, לשקול להקריב את העכברים. עכברים יכולים להיות מורדמים באמצעות מנת יתר של שאיפה isoflurane, מוסדית או אחרת, אישר IACUC שיטות.
חלק 2: Necropsy והקציר של קולון
- לחשוף את הצד הגחוני של העכבר והרגליים מאובטח כדי להבטיח גישה בלא הפרעה אל הבטן. רטוב לגמרי את הבטן עם אתנול 70%.
- תפוס את קו האמצע של הבטן עם מלקחיים רקמות להאריך כלפי מעלה ובכך האהלה את העור. השתמש קנס שקצהו מספריים כדי לחתוך את הבטן ובכך חושפים את תכולת הבטן. הרחבת חתך עד קצה של תהליך xyphoid על קו האמצע ולאחר מכן להרחיב לאורך הצד הנחות של שולי costal בילטרלי.
- זהה את המעי הדק, cecum, והמעי הגס. בזהירות לנתח / להקניט את המעי הגס מן mesentery שמסביב. Transect המעי הגס עמוק בתוך האגן כדי לשחרר את המעי הגס והרקטום דיסטלי ו. Transect המעי הגס בשוליים colonocecal לשחרר את המעי הגס הפרוקסימלי. יש להקפיד במהלך תהליך זה לא לפגוע כמו ניקוי המעי הגס המעי הגס יהיה בעייתי אם ניקוב מתרחשת.
- באמצעות מחט האכלה 20 גרם ו - 10 מ"ל מזרק, לצנרר ולשטוף את המעי הגס עם קרים כקרח PBS עד eluate ברורה לחלוטין של צואה.
- בנקודה זו, אם ניתוח מאקרוסקופיים באמצעות מיקרוסקופ ביתור הוא הרצוי, נקודתיים יכול להיות קבוע בשם "נקניקיות". אם ניתוח היסטולוגית בלבד הרצוי מאשר להמשיך חלק 4 "ביצוע רולס שוויצרי לניתוח היסטולוגית של קוליטיס חריפה".
חלק 3: עיבוד כמו "נקניקיות" לניתוח מקרוסקופית של המעי הגס שלמים
- חשוב לשמור על הכיוון הנכון של המעי הגס, ולכן, להשאיר את הקצה הדיסטלי של המעי הגס הקרוב למפעיל. חותכים שתי חתיכות תפר שאינם נספגים (SP116 1.5 משי קלוע מטרי), אחד כ 1 ס"מ אורך, השני 2 אינץ.
- השתמש חתיכה של 2 ס"מ תפר לקשור את הקצה הדיסטלי קרוב לשוליים ככל האפשר, תוך שמירה חותם טוב.
- המקום מחט האכלה 20 גרם המכילה 5 מ"ל של 10% בופר פוספט פורמלין לתוך סוף הפרוקסימלי של המעי הגס. Loosely לקשור את פיסת הנותרים של תפר הפרוקסימלי מיד הנורה של המחט האכלה. אחוז המעי הגס בתוקף על הנורה של המחט האכלה להזרים פורמלין עד המעי הגס מורחבת. הדקו את הקשר תפר כפי שאתה למשוך את מחט האכלה, ובכך להותיר את חדורים, המעי הגס התרחבו כמו "נקניק".
- מלא צינור חרוטי 15 מ"ל עם 10% שנאגרו פוספט בפורמלין במקום המעי הגס בצינור. תקן 24 שעות.
- יוצקים את פורמלין ולהחליף EtOH 70% עבור 24 שעות נוספות. (נקודתיים ניתן לאחסן EtOH 70% ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר).
- הסר את המעי הגס מהצינור חרוטי לחתוך את החוטים בכל קצה עם אזמל, נזהר לא לפגוע המעי הגס. זכרו כי בסופו הדיסטלי יש את פיסת הארוך ביותר של מחרוזת. גזור longitudinally מן דיסטלי סוף הפרוקסימלי של המעי הגס, כך הוא יוצר גיליון ארוך. בשלב זה, המעי הגס ניתן לראות תחת מיקרוסקופ לנתח.
חלק 4: ביצוע רולס השוויצרית לניתוח היסטולוגית של קוליטיס חריפה
- חשוב לשמור על הכיוון הנכון של המעי הגס, ולכן, להשאיר את הקצה הדיסטלי של המעי הגס הקרוב למפעיל.
- מדוד את אורך המעי הגס. מדד זה מצביע פעם נוספת חומרת הפציעה. קוליטיס מעלה בצקת ומקצר את אורך המעי הגס הכוללת.
- באמצעות קנס שקצהו מספריים, לחרות longitudinally מ דיסטלי סוף הפרוקסימלי של המעי הגס. שימוש במלקחיים היטה בסדר לתפוס או קצה של החתך פתוח רוחבית לעבוד בדרך שלך distally-> proximally, ובכך להציג את המעי הגס כמו סדין שטוח.
- רולינג המעי הגס דורש זוג מלקחיים טכניקה two ריקות. אחוז אחד לקצה השוליים דיסטלי עם מלקחיים. המשך ברצף לגלגל את המעי הגס על ידי החלפה ושחרור של מלקחיים הליך לשוליים הפרוקסימלי. לפיכך יצירת ספירלה עם מימד שלישי או "Roll השוויצרית".כדי לשמור את הטופס התגלגל, לתפוס את הגליל היטב עם מלקחיים transect זה עם מחט 27G1 / 2. Secure את המחט על ידי כיפוף המחט מיד עם יציאתו את הגליל.
- מניחים את להתגלגל קלטת רקמות שכותרתו כראוי ומניחים בצנצנת של 10% בופר פוספט פורמלין בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות על מנת להבטיח קיבוע הרקמה.
- יוצקים את פורמלין ולהחליף EtOH 70% עבור 24 שעות נוספות. (נקודתיים ניתן לאחסן EtOH 70% ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר).
- לאחר מדגם תוקנה, זה יכול להיות מוטבע פרפין, מחולק רכוב על שקופיות לניתוח היסטולוגית.
חלק 5: תוצאות נציג
המודל DSS עבור קוליטיס חריפה מאפשרת לחוקר להשיג, לתקן, ולנתח נקודתיים כי מודלים קוליטיס חריפה. כאשר גליל שוויצרי נחתך רכוב, יש טופס פרוסה נציג של המעי הגס כולו אם התגלגל כראוי (איור 1). גליל רכוב יכול להיות מוכתם H & E כדי לקבוע את מידת הנזק המעי הגס, מסוף (בפנים) דיסטלי עד הסוף (בחוץ) פרוקסימלי (איור 2). אימונוהיסטוכימיה ניתן גם לבצע גליל השוויצרי לזהות ולכמת מחלחל דלקתיות. אם שיטת נקניק שבוצעה כהלכה, המעי הגס קבוע יהיה מורחבים על פני הרירית כולה ניתן להשפיע בקלות מתחת למיקרוסקופ הניתוחים (איור 3).
באיור 1. כהלכה-להורג "פחזנית". (א) המעי הגס הוא התגלגל מן דיסטלי לסיים הפרוקסימלי, transected עם מחט ומאובטחת על ידי כיפוף סופו של המחט. זה ממוקם אז קלטת רקמה קיבעון. (ב) H & E מוכתם סעיף 5 מיקרומטר של גליל השוויצרי עשוי המעי הגס של עכבר שטופלו DSS (ד = המעי הגס הדיסטלי p = המעי הגס הפרוקסימלי).
איור 2. DSS נקודתיים שטופלו להראות סימנים של דלקת חריפה. נזק דלקת הקריפטה ניכרים DSS המעי הגס שטופלו לעומת בקרת מים מטופלים.
איור 3. דוגמה "נקניק". נקניק רווי פורמלין והרחיב לחלוטין. הזווית הקלה תהיה משנית להציג עקמומיות הטבעית של המעי הגס. נקניק נפתח צריך לשכב.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה יכול להיות שונה למודל פגיעה חריפה, פגיעה לתקן או פציעה כרונית תהליכים הגס.
פגיעה חריפה שינוי:
מודעה DSS טיפול lib עבור 4-6 ימים ואחריו להקריב מיידית
פגיעה, שינוי ותיקון:
פגיעה עם 4-6 ימים של טיפול DSS וא...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי ונדרבילט IACUC.
תודות
המימון הניתנים על ידי NIH (1 DK080221 K08-01) וקרנות ונדרבילט פיתוח מוסדיים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Dextran Sulfate Sodium Salt | USB Corp., Affymetrix | 9011-18-1 | משקל מולקולרי 40,000-50,000 |
| פורמלין פוספט במאזן pH בריכוז 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-474-06 | |
| קסטות TISSUE PATH Macrosette | Fisher Scientific | 15182706 | |
| מזרק BD 10 ml | BD Biosciences | 309604 | |
| אתנול (Ethyl Alcohol) | Pharmco-AAPER | E190 | יש לדלל ל-70% עם מים מזוקקים |
| מחט הזנה ישרה 20G | VWR international | 20068-612 | |
| מחט PrecisionGlide 27G1/2 | BD Biosciences | 305109 | |
| מספרי ניתוח עם קצה חד/קהה | VWR international | 82027-588 | |
| פינצטת Waugh | VWR international | 82027-428 | |
| חוטי תפירה שאינם נספגים | LOOK Surgical | SP116 | |
| נייר בלוט Whatman | VWR international | 28298-020 | לחתוך לפי הצורך |
| מסנן Cellulose Acetate (SFCA) נטול חומרים פעילי שטח של Nalgene | Cole-Parmer | EW-06731-2 | |
| קליבר דיגיטלי מסיבי סיבי פחמן | Fisher Scientific | 15-007-958 |
מקורות
- Okayasu, I. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Martinez, J. A. Deletion of Mtgr1 sensitizes the colonic epithelium to dextran sodium sulfate-induced colitis. Gastroenterology. 131 (2), 579-588 (2006).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Mahler, M. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, G544-551 (1998).
- Aharoni, R. Immunomodulatory therapeutic effect of glatiramer acetate on several murine models of inflammatory bowel disease. J Pharmacol Exp Ther. 318 (1), 68-78 (2006).
- Hahm, K. B. Loss of transforming growth factor beta signalling in the intestine contributes to tissue injury in inflammatory bowel disease. Gut. 49 (2), 190-198 (2001).
- Green, B. T. Adrenergic modulation of Escherichia coli O157:H7 adherence to the colonic mucosa. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 287 (6), G1238-1246 (2004).
- Dieleman, L. A. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
