סינפסות Glutamatergic יכול לעבור ממצב פעיל למצב שקט. אנו מראים כי מצב פעילות presynaptic בתרבות ניתק של נוירונים מכרסם הוא מדמיין באמצעות טופס ניתן לתקן של צבע FM1-43 לדמיין סינפסות פעיל immunostaining עם נוגדן vGluT 1-לדמיין כל סינפסות הגלוטמט.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
פלסטיות בבסיס Synaptic סביר היכולת של מערכת העצבים ללמוד ולזכור ואולי גם לייצג ההסתגלות שמונעת אחרת עלבונות פגיעה מלהפוך neurotoxic. אנחנו כבר לומדים צורה של פלסטיות presynaptic כי הוא מעניין, בין השאר משום שהוא מבוטא מיתוג דיגיטלי לסירוגין היכולת מסוף s presynaptic לשחרר שלפוחית המכילה את הנוירוטרנסמיטר גלוטמט. כאן אנו להדגים פרוטוקול המאפשר הדמיה מצב הפעילות של מסופי presynaptic בתרביות תאים ניתק מוכן מן ההיפוקמפוס מכרסמים. השיטה מסתמכת על גילוי סינפסות פעיל באמצעות מכתים עם צורה ניתן לתקן את צבע styryl FM1-43, נפוץ תווית שלפוחית סינפטית. פרופיל זה מכתים הוא בהשוואה immunostaining של המסופים אותו עם נוגדן כנגד המשלח גלוטמט שלפוחי 1 (vGluT-1), כתם נועד תווית כל סינפסות הגלוטמט ללא קשר למצב ההפעלה. אנו מוצאים כי גירויים depolarizing להשרות השתקה presynaptic. האוכלוסייה של סינפסות כי הוא שותק בתנאי ההתחלה יכול להיות מופעל על ידי השתקת חשמל ממושכת או על ידי הפעלה של מסלולי איתות cAMP.
פרוטוקול
תרבות הכנה
- הכנת תרביות תאים ניתק של תאים בהיפוקמפוס חולדה או עכבר מיום הלידה 0-3 חיות 1. הנוירונים שלנו לדבוק monolayer astrocyte הבסיסית, אשר בתורו שומרת על שכבת קולגן להתפשט על coverslip 0 מספר עובי. פלייט הנוירונים בצפיפות של כ 500 תאים לסנטימטר מרובע.
- אפשר תרבויות לגדול במשך 10-14 ימים כדי לאפשר פיתוח התבגרות הסינפטי ו. פנקו את התרבויות ביום במבחנה 4 עם AraC antimitotic לעצור צמיחה גליה נוספת. הזנת אותם יום במבחנה 5 עם חילופי בינוני וחצי עם Neurobasal בינוני פלוס תוסף B27 כד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
משמעות
- בדרך כלל סינפסות נחשבים פועלים על ידי שחרור משדר בהסתברות למדידה. עבודה על ידי עצמנו ואחרים עושה את זה ברור כי הסינפסות חלקם עקשן שחרור הנוירוטרנסמיטר, למרות מערך מלא של טרנספורטר הנוירוטרנסמיטר שלפוחי ושאר סמנים presynaptic מפתח 2, 6-8. הראינו בעבר כי פעילות הרשת הבסיס בנוירונים הוא קריטי כדי לשמור על אוכלוסייה זו של סינפסות פעיל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים DA018109 ו MH78823, ו-NIH Neuroscience Blueprint Core גרנט P30NS057105 כדי אוניברסיטת וושינגטון.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| FM1-43FX | Invitrogen | F-35355 | קיים גם FM4-64FX עם הזזה לאדום, אך הוא לא הוכח כמתאים למספיק למבחני השתקה פרה-סינפטית. |
| Advasep-7 | CyDex | AR-0A7-001 | |
| vGluT-1 | EMD Millipore | AB5905 | |
| Alexa 647-conjugated anti-GP | Invitrogen | A-21450 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
מקורות
- Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Olney, J. W., Mennerick, S.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
