מיצוי חלבון עבור ניתוחים proteomic במינים פטרייתי דורש רמה גבוהה של סטנדרטיזציה כדי להתבצע על פי מידע המינימום על ניסוי (MIAPE) הנחיות proteomic. אנו מציגים וידאו פרוטוקול הכולל הליך מזעור הטיה במהלך הניסוי אינדוקציה רעלן והוצאה חלבון מן Fusarium spp.
מאמר שיטה
רעלן אינדוקציה ואת מיצוי חלבון מן Fusarium Spp. תרבויות ללימודי proteomic
במאמר זה
סיכום
תקציר
Fusaria הם פטריות פילמנטיות מסוגל לייצר רעלים שונים. Fusarium mycotoxins כגון deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric חומצה, moniliformin, וכו '.. יש השפעות שליליות על הבריאות הן של בני אדם וחיות וחלקם נחשבים כגורמים pathogenicity. מחקרים הראו proteomic להיות יעילים בפענוח מנגנוני ייצור הרעלן (Taylor et al., 2008), כמו גם לזיהוי גורמים פתוגניים פוטנציאל (נייר et al. 2007, Houterman et al. 2007) ב Fusaria. זה הופך אפוא יסוד להקים שיטות אמין להשוואה בין מחקרים proteomic כדי להסתמך על ההבדלים האמיתיים למצוא ביטוי חלבון בין ניסויים, זנים ומעבדות. הליך זה יתוארו לתרום ברמה מוגברת של סטנדרטיזציה של הנהלים proteomic על ידי שתי דרכים. פרוטוקול צולם משמש כדי להגדיל את רמת הפרטים ניתן לתאר בדיוק. יתר על כן, את הזמינות של נהלים סטנדרטיים כדי תהליך ביולוגי משכפל צריך להבטיח עמידות גבוהה יותר של נתונים, תוך לקיחה בחשבון גם את הגורם האנושי בתוך reproducibility הטכני של ההליך החילוץ.
פרוטוקול המתואר דורש 16 ימים להשלמת שלו: ארבעה עשר ימים עבור תרבויות יומיים להפקת חלבונים (איור 1).
בקצרה, זנים Fusarium גדלים על התקשורת מוצק במשך 4 ימים, הם מפוצלים אז ידנית ומועברים תוך גרימת מדיה שונה רעלן (יאו et al, 2008.) במשך 10 ימים. תפטיר נאסף על ידי סינון דרך שכבת Miracloth. גריסה מבוצעת בחדר קר. מפעילי שונים שבוצעו מיצוי משכפל (n = 3) על מנת לקחת בחשבון את ההטיה עקב שינויים טכניים (איור 2). הפקת התבסס על מאגר SDS / DTT כמתואר Taylor et al. (2008) עם שינויים קלים. מיצוי חלבון סך נדרש תהליך משקעים של חלבונים באמצעות Aceton / TCA / DTT כביסה חיץ בין לילה אצטון / DTT (דמות 3a, 3b). חלבונים היו resolubilized לבסוף חיץ חלבון תיוג לכמת. תוצאות ממוצא היו דמיינו את הג'ל 1D (איור 4, SDS-PAGE), לפני שתמשיך 2D ג'ל (IEF / SDS-PAGE). ההליך אותו ניתן ליישם עבור ניתוחים proteomic על התקשורת גדל אחרים ופטריות פילמנטיות אחרים (מיילס et al. 2007).
פרוטוקול
הפרוטוקול דורש 16 ימים להשלמתו. הזמן הוא מפורט באיור 1.
פרטים להכנת חיץ
- הכנת למאגר תמוגה (3mL לדגימה).
- הכנת למאגר כביסה (50 מ"ל לדגימה). מאגר זה צריך להיות מקורר מראש ומאוחסנים ב -20 ° C במקפיא עד לניתוח נוסף ושמרה על הקרח במהלך ההליך כולו.
- הכנת למאגר משקעים (20mL לדגימה). מאגר זה צריך להיות מקורר מראש ומאוחסנים ב -20 ° C במקפיא עד הצורך ושמרה על הקרח במהלך ההליך כולו.
- העבודה צריכה להתבצע מעדיפים לתוך תא קר 4 ° C.
הפטרייה מינים
שלושה זנים המשמשים מנתח proteomic סווגו להיות graminearum Fusarium על סמך תכונות מורפולוגיות שלהם תרגום התארכות-Alpha-1 גורם ניתוח (אודונל et al., 1998)
זנים אלו שייכים לאוסף ליפמן CRP-גבריאל נשמרו ואוחסנו ב - 80 מעלות 15% גליצרול.
הכנת mycelia
פטריות שעובדו על V8 במשך 4 ימים של 25 מעלות צלזיוס לסירוגין תקופה האור והחושך כל 12 שעות. תרבויות היו מפוצלים באמצעות להב סטרילי חתיכות של התרבויות הללו שימשו כדי לחסן 250 מ"ל צלוחיות Erlenmeyer המכילה 100 מ"ל של רעלן וישכנע התקשורת. Mycelia נבצרו לאחר 10 ימים הופרדו בינוני ידי סינון התרבות עם מסנן סטרילי. Mycelia נשטפו 3 פעמים עם מים סטריליים כדי להסיר שאריות בינוני ותרכובות אחרות. לאחר מכן, אנו קפא מיד את התאים על ידי הוספת חנקן נוזלי ושמר את דגימות ב -80 ° C.
תיאור כללי של מיצוי החלבון
דגימות חלבון חולצו באמצעות השיטה המתוארת 3A הדמות 3B. הדגימות היו Fusarium הקרקע בחנקן נוזלי ואת אבקת נאסף 10 מ"ל צינורות טפלון. דגימות הודגרו אז 30 דקות עם למאגר תמוגה, מורתחים במשך 10 דקות, centrifuged 2 פעמים בטמפרטורת החדר (12000g במשך 15 דקות). Supernatants נאספו מודגרות ב -20 מעלות עם משקעים חיץ בין לילה. לאחר צנטריפוגה ב 4 ° C 30000g במשך 45 דקות, את כדורי של חלבונים זירז נשטפו 3 פעמים עם אצטון קר המכילה DTT. לבסוף, היו כדורי אוויר יבש החלבונים היו resolubilized במאגר תיוג, התאמת ה-pH ל 8. מדגם קטן של 30 מ"ל הוסר עבור כימות חלבון הכולל supernatant הנותרים אוחסן ב -20 ° C עד אלקטרופורזה חלבון.
באיור 1. ציר הזמן של ההליך.
איור 2. Scheme למפעילים מרובים מדגם עיבוד.
איור 3 א. 
איור 3 ב. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 3a, או כאן לגרסה גדולה יותר של 3b דמות.
דמויות 3a-b תרשימי זרימה לתהליך מיצוי החלבון (A: יום ראשון, ב ': היום השני)..
איור 4. 1D תמונה של תמציות חלבון. חלבונים נוהלו עד הגירה מלאה של כחול עד סוף הג'ל כי היה מוכתם סגול לבה. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 4.
דיון
עניין אחרונים גישות proteomic בתוך תחום הביולוגיה פטרייתי הוביל מספר מוגבר של פרסומים באמצעות טכניקה זו (הנסקרת כמו קים et al. 2007). שיטות להפקת חלבון מסתמכים על שילוב של מיצוי הליכים, הם לעתים קרובות תיאר בקושי בסעיפים מתודולוגיים דורשים מומחיות בהתמודדות עם שיטות פתרון בעיות פוטנציאליות.
באשר "omics" גישות אחרות, הגדרת סטנדרטים עבור עיבוד מדגם נתונים היא חיונית על מנת ליצור מידע מדעי אמין. יתר על כן דגימות ונהלים של מניפולציה יש לתאר באופן הולם על מנת לאפשר פרשנות תוצאה משותף בין ניסויים שונים "omics". זה יהיה חיוני ניצול מלא של פוטנציאל הכרייה צולבות נתונים גנומיקה, metabolomics, ... (מוריסון et al. 2006). מידע מינימלי על ניסוי proteomic כבר ניסחו וקבוצות עבודה הוקמו כדי להתמודד עם כל ההיבטים של ניסוי (ג'ל אלקטרופורזה, ספקטרומטריית מסה, אינטראקציות מולקולריות, שינויים חלבון, מידענות Proteomics, עיבוד המדגם). כרגע אין מידע מוגדר זמינים הליכי עיבוד המדגם. לאור החשיבות של מיצוי הליכים חלבון בקביעת איכות הסופי של מחקרים proteomic, כדי ליישם נהלים יכולים להגדיל תקינה במסגרת הנחיות MIAPE (Taylor et al. 2007), הצענו את השימוש בפרוטוקול וידאו המפרט מדגם עיבוד. תיאור וידאו של ניסויים עשוי לתרום באופן משמעותי כדי להגדיל את מספר מידע על עיבוד המדגם שעלולים לגרום שחזור טוב יותר של "omics" ניסויים (Pasquali, 2007).
ואכן, שחזור פני מעבדות היא דרישה בסיסית כדי להבטיח את תקפות תוצאות proteomics (http://www.fixingproteomics.org). שחזור צולבת מעבדה מושפע משני גורמים: instrumentations שונים המפעילים מניפולציות שונות דגימות.
בפרוטוקול שתואר, אנו מציעים לבצע ביולוגי משכפל מעורבים מפעילי מרובים (איור 2 ו - וידאו) כדי להגביר את האמינות של הנתונים (כלומר וריאציה טכני של התוצאות נלקחת בחשבון).
ההליך המתואר להפקת חלבון מבוססת על SDS וחימום. זה היה הראו בעבר כדי להבטיח טוהר כמות טובה של חלבונים (Bridge 1996). SDS יחד עם רותחים מתמוסס קירות התא, חלבונים הידרופובי ומונע היווצרות משקעים oligomers כי להפיל של חלבונים. רתיחה מאפשר גם איון של פרוטאזות. את אותו אפקט מיוצר גם על ידי EDTA, PMSF ו מעכב פרוטאז להשלים מיני. DTT מסיר גשרים דיסולפיד פנימה בין חלבונים להקל solubilization חלבון.
על מנת להסיר SDS לפני IEF, חלבונים הם זירז ידי אצטון / TCA / DTT. יתר על כן, אצטון / TCA / DTT משקעים מאפשר הסרת חלק מזהמים כגון שומנים, חומצות גרעין, מלחי ו / או תרכובות פנוליות כאשר תרכובות אלו נמצאים. כמו SDS, מולקולות אלה ולמנוע הגירה טוב במהלך IEF. בעקבות משקעים זה, יש צורך לשטוף את החלבונים זירז ידי אצטון / DTT, על מנת להסיר TCA כפי שהוא יכול להפריע IEF.
מדגם הכנה טובה היא המפתח לתוצאות טובות. לשם כך, היא גם חיונית כדי למנוע זיהום של חלבונים מן הסביבה לעבוד עם כפפות אבקת חופשי כיבוד נהלי מעבדה טובים. מנקודת מבט טכנית, במסגרת פרוטוקול המתואר, השלבים הקריטיים ביותר להשגת כמות מספקת של חלבונים וטוהר שני שלבים. ראשית, שלב שבו שחיקה הרס מוחלט של התא חיונית לשחרור חלבונים, ושנית, טיהור חלבונים הכולל, המקיף את שלב הסרת רוב ה-DNA, שומנים ומזהמים אחרים שעשויים להפריע הגירה של חלבונים.
תודות
אנו מודים Servane Contal ובוריס Untereiner על תרומתו הטכנית שלהם. אנו מכירים את התמיכה של הפרויקט FNR "FUTOX".
חומרים
מדיה ופתרונות
מחשב כף יד: 39 גרם תפוחי אדמה דקסטרוז אגר (Difco); 1 ליטר מים מזוקקים.
אגר V8: 200 מ"ל V8 (קמפבל, ארה"ב), 2g CaCO3 (Sigma), אגר 16G (DIFCO), 800 מ"ל מים מזוקקים
גרימת רעלן התקשורת: 1g K 2 HPO 4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO 4 7H 2 O, 10 מ"ג FeEDTA, 2g חומצה גלוטמית L, סוכרוז 10g ב 1 ליטר של מים מזוקקים.
תמוגה חוצץ:
| 100 מ"ל | הריכוז הסופי | ||
| טריס-HCL pH8 | 5 מ"ל | 50mm | 1M |
| SDS | 2G או 10 מ"ל | 2% | 20% |
| DTT | 500ml | 10mm | 2M |
| EDTA | 20mL | 0.1mm | 0.5m |
| PMSF | 200 מ"ל | ||
| השלם מעכב פרוטאז מיני | 1 לוח | ||
| מים | Qsp |
רטיבות הצפת:
| 100 מ"ל | הריכוז הסופי | |
| TCA | 20mL | 20% |
| DTT | 0.1mL | 0.1% |
| Aceton | Qsp |
כביסה חוצץ:
| 100 מ"ל | הריכוז הסופי | |
| DTT | 0.1mL | 0.1% |
| Aceton | 100 מ"ל |
Labelling חוצץ (חנות ב -18 מעלות צלזיוס aliquots קטן):
| 1mL | הריכוז הסופי | |
| דשן | 140 מ"ג | 7m |
| Thiourea | 50 מ"ג | 2M |
| בחורים | 40 מ"ג | 4% |
| טריס | 30 μL | 30 מ"מ |
| מים | 1 מ"ל |
מקורות
- Bridge, P. Protein Extraction from Fungi. Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).
- Jiao, F. Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture. FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).
- Kim, Y. Proteomics of filamentous fungi. Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).
- Milles, J. Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds. Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).
- Morrison, N., Field, D. Concept of sample in OMICS technology. OMICS. 10, 127-137 (2006).
- O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. PNAS. 95, 2044-2049 (1998).
- Paper, J. M. Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum. Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).
- Pasquali, M. Video in science. Protocol videos: the implications for research and society. EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).
- Taylor, C. F. The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE). Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).
- Taylor, R. D. Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions. Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).
הדפסות חוזרות והרשאות
