הדמיה תיקון Mismatch ותגובות נייד נזק לדנ&quot;א Bacillus subtilis</em

סיכום

פרוטוקול מפורט מתואר הדמיה בזמן אמת היווצרות של קומפלקסים לתקן דנ"א Bacillus subtilis תאים.

תקציר

שני ו אאוקריוטים פרוקריוטים להגיב נזק לדנ"א באמצעות מערכת מורכבת של שינויים פיזיולוגיים. שינויים בביטוי הגנים, חלוקה מחדש של החלבונים הקיימים, ואת הרכבה של קומפלקסים חלבונים חדשים יכול להיות מגורה על ידי מגוון של נגעים דנ"א תואמים בסיס זוגות DNA. מיקרוסקופ פלואורסצנטי שימש ככלי ניסיוני רב עוצמה המאפשר הדמיה לכימות תגובות אלה ואחרים נגעים דנ"א כדי לפקח על שכפול ה-DNA מעמד בתוך הארכיטקטורה subcellular המורכב של התא החי. Fusions Translational בין חלבונים כתב ניאון ורכיבים של שכפול ה-DNA ואת מנגנון תיקון שימשו כדי לקבוע את הרמזים כי ה-DNA היעד לתיקון חלבונים נגעים שלהם מאותו מקור

פרוטוקול

גידול תרביות של תאים עבור מיקרוסקופיה

1. אחד או יומיים לפני ההדמיה, להכין את B. subtilis זן המכיל את החלבון היתוך translational אתם רוצים לדמיין. סיבובים משפט 1A ו-1B צעדים יהיה צורך לקבוע אילו תנאי גידול מספק את התמונות הטובות ביותר של זן שלך. ברוב המקרים, התאים צריכים להיות צילמו במהלך שלב הצמיחה המעריכית.

1. עבור חלק ב ' subtilis זנים (ב, זנים מסוימים הגדלים גרוע עקב שילוב של היתוך translational בין הגן של ריבית ה-GFP על מוקד אנדוגני שלה), צמיחה ראשונית יומיים לפני הדמיה הוא הכרחי עבור תמונות באיכות גבוהה. ביום הראשון, פס ב subtilis להתאמץ כדי להיות צילמו על אגר LB עם אנטיביוטיקה סלקטיבית (ים) ו דגירה לילה בשעה 30 ° C. ביום השני, לחסן 100 μl של 0.85% עם מלח מושבת יחיד לבצע שלוש דילולים סדרתי של פי 10 על צלחות אגר LB (עם אנטיביוטיקה סלקטיבית), ציפוי 100 μL של דילול כל, ואחריו הדגירה לילה בשעה 30 ° C. ביום השלישי, בחר את צלחת דילול עם צמיחה ומחוברות אור של תאים. צמיחה ומחוברות אור על צלחת תספק צמיחה בינוני עם inoculum בריא המתנע אקספוננציאלית גדל פוטנציאל להניב תוצאות הדמיה מעולה (ראה שלב 4). צעד זה שימושי במיוחד עבור הדמיה באיכות הגבוהה ביותר קרום עם כתם FM4-64.
   
2. אחרים ב זנים subtilis יכול פשוט להיות מיושם בינוני אגר סלקטיבי LB עבור מושבות יחיד עם מקל סטרילי יום לפני הדמיה דגירה לילה בשעה 30 ° C. למחרת, תאים על הצלחת זה יהיה מספיק כדי לשמש inoculum הדמיה (ראה שלב 4).
   
   הערה: לקבלת B. subtilis, תרבויות לילה במדיום נוזלי אינם מתאימים עקב שילוב של יצירת הנבגים ותגובות המניין, אשר יגרום תקופה ממושכת של צמיחה בפיגור שלב ^1.

2. בבוקרו של הדמיה, מקום 10 מ"ל של מדיום ₅₀ S7 ^1-3 לתוך בקבוק 125 מ"ל Erlenmeyer סטרילי.

3. Resuspend התאים עד 2 מ"ל של מדיום ₅₀ S7 מהצלחת LB אגר עם מושבות יחיד או בתאי אור ומחוברות להשיג inoculum.

4. הוסף מספיק S7 ₅₀ בינוני תא inoculum אל הבקבוק המכיל 10 מ"ל Erlenmeyer S7 ₅₀ בינוני תרבות עם צפיפות אופטית הראשונית נמדד ב 600 nm (OD ₆₀₀₎ של ~ 0.08-0.1. בשלב זה חשוב לי לפחות אוויר של פי 10 יחס בינוני. לפיכך, אנו משתמשים 10-12.5 מ"ל של מדיום מחוסן בתוך בקבוק 125 מ"ל Erlenmeyer.

5. לגדול בכל תרבות ב 30 ° C עד התרבות מגיע OD ₆₀₀ ~ 0.5-0.8. אמבטיות מים רועד עדיפים עם סיבובים לדקה 150-200. תרבויות תיגר עם סוכני ה-DNA אי התאמה או גרימת נזק צריך להיות בשלב מוקדם הצמיחה המעריכית OD ₆₀₀ תאים כאלה יגיעו ליעד OD ₆₀₀ לתקופה נוספת של צמיחה הנדרש לטיפול (ראה לוח 1)
לדוגמה, 2-aminopurine דורש שעה אחת של טיפול, ולכן תרבות שטופלו aminopurine-2 צריך להיות ₆₀₀ ~ OD 0.3-0.4, כך שעה אחת של טיפול / תוצאות הצמיחה OD ₆₀₀ ~ 0.5-0.8, לפיו תאים מוכנים הדמיה.

לדוגמא הכנה

1. פיפטה 300 μl של תאים בתרבית לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.

2. אם הדמיה של ממברנות הסלולר הוא הרצוי, להוסיף 1:1000 דילול של קרום FM4-64 כתם (Invitrogen) לדגום כל מפתרון מ"ג / מ"ל ​​1 המניות. טיטרציה של FM4-64 עשויים להידרש כדי להשיג את אותות הקרינה הרצויה. מגוון טיטרציה טיפוסית היא 1:100, 1:1000, ו 1:10,000.

3. אפשר הדגימות לשבת בטמפרטורת החדר לתקופה של עד עשר דקות או בעוד שקופית מכינים עם agarose 1% בטווח הבינוני Spizizens 1X כמתואר להלן (ראה שלב 1 של "הכנת שקופית").

4. אם ריכוז של התאים נדרשת, אנו מעדיפים תאים סינון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר עם מנגנון ואקום. תאים לאחר מכן ניתן לשטוף בעדינות מפני השטח של המסנן עם PBS, עוד חיץ מתאים או בינוני לפני להדמיה.

הכנת שקופיות

1. הכן agarose 1% עם 1X Spizizens.

הוסף 5 מ"ל של המניה Spizizens 10X ל 45 מ"ל ddH2O יחד עם 0.5 גרם agarose, ומיקרוגל להינמס. Agarose מותכת חמה קשה פיפטה, ביסוס agarose לא ייכנסו קצה פיפטה. Agarose צריך להיות equilibrated באמבט מים בטמפרטורה של 55-65 ° C ~ את זה כדי להזין את קצה פיפטה ללא לחיזוק בתוך טיפ.

2. צייר 20 μl של Spizizens עם agarose מומסת 1% אל קצה פיפטה. פיפטה טיפה אחת (כ 1-2 μL) של הפתרון agarose לתוך שקופית היטב (אנחנו משתמשים גם 15 שקופיות, ראה טבלה 2) כדי ליצור רדוד רפידות agarose. Agarose יהיה לגבש באופן מיידי. שקופיות חייב להיות גם מיד לפני יישום של התאים. אם כריות agarose נותרים בטמפרטורת החדר לבד, הם יכולים תוך דקות מייבשים ולהיות שמיש.

רפידות agarose צריך להיות מרוכז ומלא כל טוב אבל יש גובה מינימום כדי למנוע שיבוש coverslip, אם הטיפות הן גבוהות מדי (כמו בועה) או אם המדגם מתפשט גם מעבר לגבול, פשוט לסחוב לנקות היטב עם Kimwipe ולהחיל חדש agarose כרית.

3. החל המדגם כולו 300 μl (ראה שלב 6) לשקופית, מופץ על החלק העליון של כל משטח agarose. זו כמות של תאים אמור להיות מספיק כדי לכסות את כל טוב בשקופית.

4. אפשר להחליק עמוסה התאים לשבת בטמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס) במשך כ עשר דקות. צעד זה יאפשר את התאים להתיישב על כרית agarose להיות נייח ומוכן הדמיה. עבור צרכים מיוחדים בטמפרטורה זו ייתכן שיהיה צורך לשנות, למשל, בעת ביצוע הניסויים הדורשים שינוי הטמפרטורה ^4.

5. לשאוב משם את המדיום עודף גם מבלי להסיר את כל הרפידות עצמם.

6. החל את coverslip לשקופית, לחיצה בחוזקה ובאופן שווה, אבל בעדינות, על פני שטח של השקופית. ודא כי להחליק כיסוי נגד לשקופית וכי להחליק לכסות לא עולה מעל השקופית.

ויזואליזציה של תאים

1. רבים מיקרוסקופים פלואורסצנציה שונים יעבדו היטב. זה קריטי יש עדשה 100x טבילה שמן. המעבדה סימונס משתמש:

• אולימפוס BX61 מיקרוסקופ המצויד 1,45 NA TIRFM העדשה 100x טבילה שמן אובייקטיבי
• Hamamatsu ORCAR ² CCD מקורר מצלמה
• Lumen 200 מתכת קשת (לפני) מקור אור.
• לצורך זיהוי של ה-GFP (FITC), עירור לסנן 460-500 ופליטה 510-560
• לצורך זיהוי של FM4-64 (TRITC), עירור לסנן 510-560 ופליטה 572-648.
• תמונות שנתפסו באמצעות SlideBook 4.2 (איור 1)

2. תביאו את התאים אל המוקד באמצעות אור לבן.

3. צלמו את התמונה באמצעות מסננים מתאים fluorophore כל אחד.

נציג תוצאות

תמונות נציג מוצגים (איור 1). GFP מוקדים צריך להיות מוגדר היטב, בעוד FM4-64 מכתים צריך להיות בהיר ^4-7. תמונות GFP או קרום יכול להיות פסאודו בצבע עם כל צבע, על מנת לאפשר את התמונה באיכות הגבוהה ביותר שיוצגו מבלי לאבד נתונים.

איור 1: תמונות GFP נציג B. subtilis חלבונים היתוך translational. חלבוני ה-GFP מוצגים ירוק, בעוד מכתים FM4-64 ממברנה מוצג באדום. סרגל סולם לבן מציין 3 מיקרומטר (א) MutS-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: mutS - GFP (SPC), amyE: Pspac mutL (חתול)]. בנוכחותו של 600 מיקרוגרם / מ"ל 2-aminopurine ו IPTG 1 מ"מ. FM4-64 אות לא מוצגת על מנת להראות בצורה ברורה יותר MutS-GFP מוקדים (ב) MutL-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: mutL: mutL-GFP (SPC)].. בנוכחות aminopurine-2 (C) DnaX-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: dnaX: dnaX-GFP (SPC)]. (ד) RecA-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: recA: recA-GFP (SPC)] בנוכחות של 20 ng / mL mitomycin ג (E) TagC-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: tagC: tagC-GFP (SPC) ] בנוכחות של 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​mitomycin ג

טיפול / ריכוז או כמות	פונקציה	זמן הדגירה של
Mitomycin C (MMC) [20-150 ng / mL]	סוכן ה-DNA אלקילציה	1 שעה
2-aminopurine (2-AP) [600 מיקרוגרם / מ"ל]	גרימת אי התאמה	1 שעה
Hydroxyurea (האוניברסיטה העברית)	מכלה dNTPs	3 שעות
אור אולטרה סגול (UV) 20 J/m2	תימין, תימין הדימרים ו 6-4 photoproducts	משתנה בהתאם למקור, בדרך כלל 20 שניות
אפור (קרינה מייננת) 5-100 Gy	גדיל שוברת פעמיים, הפסקות גדיל יחיד נזק אתרי בסיס	משתנה בהתאם למקור

"> בטבלה 1. סיכום של ה-DNA ואת גרימת נזק טיפולים אי התאמה

שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
שקופית Multitest, 15-היטב	MP Biomedicals	6041505E
כיסוי זכוכית מיקרוסקופ	דיג	12-544-B
Agarose	דיג	BP160-500
Mitomycin C	סיגמא	M0503-2MG	mutagen, ללבוש כפפות
2-Aminopurine	סיגמא	A3509-טבליות של 250	כפפות
Hydroxyurea	סיגמא	H8627-25 גרם	כפפות
FM4-64	Invitrogen	T13320	אור רגיש

טבלה 2. רשימת ריאגנטים ספציפיים ציוד:

דיון

ניסוי וטעייה נדרשים למצוא את התנאים החשיפה לתמונות באיכות הגבוהה ביותר עבור כל זן, אנו מוצאים כי 1 אלפית השנייה מתאים תמונות אור לבן, תוך חשיפה של 100-2000 ms המתאימים GFP (FITC) ו FM4-64 (TRITC ) תמונות. זמן חשיפה ישתנו בהתאם לציוד הדמיה בשימוש. אנו ממליצים להשתמש זן אחד לכל שקופית 15 גם מיקרוסקופ הדמיה הפשוטה ביותר, כמו איכות פנקס דיפוזיה של תאים מהגבול כרית עלולה לסבך בידול זן אם זנים רבים נמצאים בשקופית אחת. איכות תמונה ישירות תלוי באיכות של כרית agarose שבו החיידקים נחים. התמ...

חומרים

פתרון מתכונים ספציפיים ^1:

10x S7 ₅₀ מלחים
0.5 מ מגבים
100 mM אמוניום סולפט
50 מ"מ פוספט אשלגן Monobasic
סנן לעקר, ועוטפים S7 ₅₀ מדיה בנייר לפני אחסון

100x מתכות
0.2 מ MgCl ₂
70 mM CaCl ₂
5 מ"מ MnCl ₂
0.1 מ"מ ZnCl ₂
100 מיקרוגרם / מ"ל ​​תיאמין HCl
2 מ"מ HCl
0.5 mM FeCl ₃ *
DH ₂ O לנפח סופי
* FeCl ₃ יש להוסיף שעברה, על מנת למנוע משקעים.
לאחר עיקור לסנן, לעטוף 100x פתרון מתכת בנייר כסף.

S7 ₅₀ מדיה
1x S7 ₅₀ מלחים
1x מתכת
1% גלוקוז
0.1% גלוטמט
40 מיקרוגרם / מ"ל ​​טריפטופן
40 מיקרוגרם / מ"ל ​​פנילאלנין
מזוקקים H ₂ O לנפח סופי

Spizizens 10x (גרם / ליטר)
151.4 mM אמוניום סולפט (20 גרם / L)
803.8 mM אשלגן פוספט Monobasic (140g / L)
440.9 mM אשלגן פוספט Dibasic (60G / L)
34.0 נתרן mM ציטראט (10g / L)
16.6 mM MgSO ₄ (2G / L)
DH ₂ O לנפח סופי
סנן לעקר