In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

סיכום

וידאו זה מראה ניסויים עם ניתוח בדיעבד של חלבונים אינטראקציות על ידי שימוש במיקרו בדוגמת משטחים. הגישה מציעה את האפשרות לזהות אינטראקציות חלבון בתאים חיים, והוא משלב יכולות התפוקה גבוהה עם אפשרות לחלץ מידע כמותי.

תקציר

להתיר את רשת אינטראקציה של מולקולות

פרוטוקול

Microcontact הדפסה:

1. לגזור שדה micropattern של הבול PDMS באמצעות אזמל
2. לשטוף את השדה המכיל את micropattern על ידי שטיפה זה עם אתנול (100%) ומים מזוקקים.
3. יבש חותמת PDMS עם חנקן או גז ארגון.
4. פיפטה 50 μl-BSA Cy5 פתרון עבודה (0.67 מ"ג / מ"ל) על הבול PDMS כך שהשדה כולו micropattern מכוסה פתרון. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
5. לשטוף את השדה micropattern על ידי שטיפה עם בופר פוספט (PBS) ומים מזוקקים.
6. יבש PDMS עם חנקן או גז ארגון.
7. מניחים את החותמת PDMS תחת כובד משקלו על גבי באמצע coverslip אפוקסי מצופה אחד דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בצלחת פטרי.
8. לייבל את המיקום של החותמת PDMS על הישבן של coverslip לבין הרצועה החותמת משקופית עם מלקחיים.
9. Stick Secure חותם הכלאה קאמרית מעל שדה microcontact מודפס על coverslip. התווית עוזר למקם את מרכז השדה.
10. פיפטה 60 streptavidin μl עבודה פתרון (50 מיקרוגרם / מ"ל) לתוך תא התגובה דגירה המדגם עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר.
11. לשטוף את המדגם עם 1 מ"ל PBS על ידי הוספת מאגר ליציאת אחד של החדר ואת הסרתו בו זמנית בנמל השני עם משאבה.
12. פיפטה 60 עובדים μl biotinylated פתרון נוגדן (10 מיקרוגרם / מ"ל ​​PBS בתוספת 0.1% Tween 20: "PBST") לתוך תא התגובה דגירה של 60 דקות בטמפרטורת החדר.
13. לשטוף את המדגם עם 1 מ"ל PBST ולאחר מכן 1 מ"ל PBS על ידי הוספת מאגר ליציאת אחד של החדר והסרת אותו שוב בנמל השני עם משאבה.
14. חנות משטחי micropatterned ב PBS בחושך בטמפרטורת החדר עד תאים מוכנים זריעה.

דגירה של תאים על פני השטח micropatterned:

1. לגדל תאים חסיד אל מפגש 50% צלחת 3 רקמות ס"מ תרבות.
2. ניתוק התאים לבטא הפיתיון טרף חלבונים עניין עם פתרון Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) חומצה צנטריפוגות 5 דקות ב 1000 סל"ד.
3. בטל supernatant ו לפזר את התא גלולה במדיום הגידול פי.
4. צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 סל"ד.
5. בטל supernatant ו לפזר את התא גלולה במדיום הגידול המתאים.
6. הבורסה PBS מהאולם תגובה על ידי coverslip micropatterned μl 60 השעיה של התא.
7. יצירת תא humidified על ידי השריית משטח סטרילי במים מזוקקים ומכניסים אותו לתוך צלחת פטרי כדי למנוע מדגם ריצה יבשה.
8. דגירה התאים על פני הלילה בשעה 37 ° C באווירה 5% CO ₂ על משטחים micropatterned.
9. לפני ניתוח תאים במיקרוסקופ, חילופי בינוני שנאגרו על ידי פתרון של האנק מלח כולל Ca ^{2 +} ו - Mg ^{2 +.}

מיקרוסקופית:

1. Coverslip ממוקם על הר מתאימים את המורפולוגיה התא נבדק תחת אור לבן.
2. האיכות של ה-BSA Cy5 דפוסי נבדק על ידי עירור ב 647 ננומטר.
3. Micropatterns של חלבון פלואורסצנטי טרף (GFP או YFP) נרשמות 488 או 514 ננומטר תחת סך עירור פנימית השתקפות (TIR).

נציג התוצאות:

אם יש אינטראקציה בין חלבונים בתאים היעד גדל על משטח micropatterned, הטרף יעברו חלוקה מחדש הפיתיון. Micropattern וכתוצאה מכך ניתן דמיינו לפי תווית של חלבון פלואורסצנטי את הטרף. חשוב לציין את הניגוד המתקבל מספק מדידה ישירה של כוח האינטראקציה (ראה איור 1). לכן הערכה פשוטה של ​​אינטראקציה של שני חלבונים הופך אפשרי - ללא צורך להמשיך ולעבד את הנתונים העיקריים שנמדדו.

באיור 1. סידור מחדש של הפיתיון בתוך קרום התא פלזמה לחיות בעוצמות אינטראקציה שונה. תמונות TIR של תאים T24 transfected עם (א) CD71-GFP על נוגדן CD71, (ב) ו - CD4 YFP cytosolic על נוגדנים CD4 ו - (ג) GPI-GFP-DAF-CD59 על נוגדן microbiochips מוצגים. נתונים אופייניים עבור חזקה (א), לא (ב) או אינטראקציה חלשה (ג). (א) מובא מן (Weghuber et al., In press), (ב) מ - (Schwarzenbacher et al. 2008).

דיון

הסרטון מלווה מדגים שיטה לאיתור חלבונים אינטראקציות קרום הפלזמה של תאים חיים (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, in press). בעיקרון, כל פלטפורמה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF יכול לשמש כמערכת readout. רק כאשר רגישות גבוהה הוא הרצוי (למשל לצורך זיהוי של מולקולות בודדות), מיקרוסקופים מתקדמים יידרש. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר בנקודות קריטיות הבאה במהלך תהליך ההכנה דורש תשומת לב מיוחדת:

1. Cy5 מניות חנות פתרון בתנאים כהה, כדי למנוע הלבנת של fluorophore ולהכין את BSA-Cy5 פתרון לעבוד טרי לפני הדפסת microcontact.
2. היזהר שלא לשרוט את micropattern על PDMS עם קצה פיפטה ו דגירה המדגם בתנאים כהה, כדי למנוע הלבנת של fluorophore.
3. שים את coverslip על משטח סטרילי כדי למנוע הידבקות של שקופיות הזכוכית כדי בצלחת פטרי. לאחר חותמת PDMS דבק כדי להחליק את הזכוכית, לא להזיז אותה.
4. הימנע בועות אוויר בתא התגובה דגירה המדגם בתנאים כהה, כדי למנוע הלבנת של fluorophore.
5. אל תתנו המדגם יבש במשך יותר מ 2 דקות, כדי למנוע היווצרות של גבישי מלח.
6. עבור ניתוק של התאים לא משתמשים טריפסין כפי לדבוק הרצון תחום תאי של חלבונים בממברנה ביטוי עד כה. הימנעות טריפסין יהיה מועיל חלבונים עם תחלופה נמוכה כדי ליצור micropatterns מיד לאחר ההתקשרות של תאים על פני השטח.
7. הפיקוח על מספר התאים מודגרות במיקרוסקופ ולוודא כי התאים אינם מגיעים יותר מ 30-50 מפגש%. ודא כי תאים מופרזת יוסרו לאלתר בשל המצורף מהירה של תאים על פני השטח נוגדן מצופה.
8. מגלשות רק עם איכות גבוהה-BSA Cy5 דפוסי ניתן להשתמש לצורך ניתוח נוסף.
9. הביטוי יציבה של חלבון פלואורסצנטי טרף עדיפה בשל מספר גדול יותר של תאים ניתן לנתח לכל סריקה.
10. התאמה נאותה TIRF היא הכרחית כדי להמחיש דפוסי בשל הרקע cytosolic.

הטכניקה מיקרו דפוסים מציע מספר אפשרויות לניתוח אינטראקציות בין חלבונים. ראשית, יחד עם כימות של המקומיים, חלבונים אינטראקציות החליט מרחבית גם זיהוי של אינטראקציות חלשות או עקיף אפשרי בלי החיסרון של מתן מספר גבוה של תוצאות חיוביות או שליליות שגויות. שנית, היא מאפשרת לנתח חוקר חלבונים אינטראקציות קרום הפלזמה של תאים חיים, אשר קשה להשיג באמצעות גישות ביוכימיות כמו מסך 2-היברידית. שלישית הגישה מאפשרת זיהוי של הפיתיון טרף אינטראקציות כי הם מווסתת על ידי שינויים סביבתיים כמו טמפרטורה, נוכחות של חלבונים שונים או מולקולות אחרות או שלאחר translational שינויים. לפיכך assay מאפשר מאפננים ההקרנה של זוג אינטראקציה נתון בהקשר של תאים חיים. יתר על כן, על ידי הקטנת צפיפות השטח של ליגנד ללכוד או שימוש ligands חד ערכי, ניתוח של מצב המנוחה הופך אפשרי. לבסוף, אם פלטפורמות סריקה נאותה משמשים, את מספר התאים ניתח גבוה מספיק כדי להתאים לדרישות תפוקה גבוהה של חברות התרופות להקרנה סמים (Ramm, 2005).