DNA-איזוטופ יציב חיטוט היא שיטת טיפוח עצמאית לזהות ולאפיין הקהילות פעיל של מיקרואורגניזמים המסוגלים ניצול מצעים ספציפיים. הטמעת מצע מועשר באיזוטופ הכבד מוביל התאגדות של אטומים שכותרתו לתוך ביומסה של חיידקים. שיפוע ultracentrifugation צפיפות מאחזר DNA שכותרתו עבור ניתוחים מולקולריים במורד הזרם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
DNA-איזוטופ יציב חיטוט (DNA-SIP) היא טכניקה רבת עוצמה לזיהוי מיקרואורגניזמים פעיל להטמיע מצעים פחמן מסוים וחומרים מזינים לתוך ביומסה הסלולר. ככזה, זו טכניקה טיפוח עצמאית כבר מתודולוגיה חשוב עבור הקצאת פונקציה מטבולית של קהילות מגוונות המאכלסים מגוון רחב של סביבות יבשתי מימיים. לאחר דגירה של המדגם סביבתי עם איזוטופ יציב, תרכובות שכותרתו, חומצות גרעין חילוץ נתונה ultracentrifugation צפיפות שיפוע חלוקה הדרגתי לאחר נפרד חומצות גרעין של צפיפויות שונות. טיהור של ה-DNA של צזיום כלוריד מאחזר שכותרתו תווית ה-DNA לאפיון מולקולרי הבאים (לדוגמה, טביעת אצבע microarrays, ספריות שיבוט, metagenomics). פרוטוקול זה מספק וידאו יופיטר חזותי שלב אחר שלב ההסברים של פרוטוקול עבור שיפוע צפיפות חלוקה ultracentrifugation שיפוע, ושחזור של ה-DNA מסומן. הפרוטוקול כולל גם נתונים מדגם SIP ומדגיש טיפים חשובים מזהיר כי יש לקחת בחשבון כדי להבטיח ניתוח מוצלח SIP-DNA.
פרוטוקול
1. הכנה של ריאגנטים
DNA-SIP מחייב שימוש ריאגנטים כי צריכים להיות מוכנים מראש של ההליך בפועל. הנחיות להכנת כל אחד מגיב המפורטים בסעיף זה שונו מן קודמת SIP פרוטוקול 1.
- צזיום כלוריד (CsCl) פתרון להכנת הדרגתיים SIP - הכן פתרון 7.163 M CsCl בהדרגה על ידי המסת 603.0 גרם של CsCl במים מזוקקים deionized (DDH 2 O) נפח סופי של 500 מ"ל. היזהר שלא יעלה על 500 מ"ל! התחממות הפתרון מעט תוך ערבוב יעזור לפזר כל CsCl. Aliquot הפתרון הסופי aliquots אטום. במעבדה שלנו, מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תכנון נכון של איזוטופ יציב ניסויים חיטוט היא בעלת חשיבות מכרעת לקבלת DNA שכותרתו לעיל הקהילה רקע תווית. שיקולים הקשורים מדגם פעמים הדגירה, ריכוז המצע, תנאי הדגירה (חומרים מזינים כגון לחות תוכן אדמה), בין האכלה שכפול נדונו במקום אחר 10,18 ו - אנו ממליצים להתייעץ עם הקורא פרסומים אלה בעת תכנון הדגירה SIP. לגבי הפרוטוקול הנוכחי, ראוי להעיר על שיקולים נוספים הקשורים הפרשנות של נתוני ה-SIP הדרגתיים. בשל אופיו של תהליך ultracentrifugation, חשוב לכלול בנוסף שולטת כגון תרבויות .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט אסטרטגי ומענקים דיסקברי JDN מן למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| Bromophenol Blue | ריאגנט | Fisher Scientific | BP115-25 | |
| צסיום כלוריד | ריאגנט | Fisher Scientific | BP210-500 | |
| אתנול, בדרגת ריאגנט | ריאגנט | Sigma-Aldrich | 652261 | |
| אתידיום ברומיד | ריאגנט | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| חומצה הידרוכלורית | ריאגנט | Fisher Scientific | 351285212 | |
| פוליאקרילאמיד ליניארי | ריאגנט | Applichem | A6587 | |
| פוליאתילן גליקול 6000 | ריאגנט | VWR international | CAPX1286L-4 | |
| אשלגן כלוריד | ריאגנט | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
| נתרן כלוריד | ריאגנט | Fisher Scientific | S2711 | |
| גרגרי נתרן הידרוקסיד | ריאגנט | Fisher Scientific | S3181 | |
| Tris base | ריאגנט | Fisher Scientific | BP1521 | |
| Dark Reader | ציוד | Clare Chemical | DR46B | |
| מיקרוצנטריפוגה | ציוד | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| Nanodrop 2000 | ציוד | Fisher Scientific | 361013650 | |
| משאבת עירוי | ציוד | Braintree Scientific, Inc. | N/A | מספר דגם: BSP ראו www.braintreesci.com לפרטי הזמנה. |
| מכשיר לאיטום מבחנות | ציוד | Beckman Coulter Inc. | 358312 | |
| אולטרצנטריפוגה | ציוד | Beckman Coulter Inc. | ||
| רוטור לאולטרצנטריפוגה | ציוד | Beckman Coulter Inc. | 362754 | |
| מקור אור על-סגול | ציוד | UVP Inc. | 95-0017-09 | כל מקור UV יספיק |
| מגן פנים לאור על-סגול | ציוד | Fisher Scientific | 114051C | |
| פקקי גומי בוטיל, אפורים | חומר | Sigma-Aldrich | 27232 | |
| מבחנות צנטריפוגה | חומר | Beckman Coulter Inc. | 342412 | |
| מחט תת-עורית, 23 gauge, אורך 2” | חומר | BD Biosciences | 305145 | |
| מבחנות מיקרופוג, 1.5 mL | חומר | DiaMed | AD151-N500 | |
| אטמים פתוחי מרכז, קוטר 20 mm | חומר | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
| פיפטות פסטור, זכוכית | חומר | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
| טיפים לפיפטה | חומר | DiaMed | BPS340-1000 | מספר הקטלוג הוא עבור טיפים של 200 μl. ניתן לרכוש טיפים של 10 או 20 μl מאותו ספק |
| צינורית משאבה, קוטר פנימי 1.5 mm x עובי דופן 1.5 mm | חומר | Appleton Woods | ||
| מבחנות עם פקק הברגה, 15 mL | חומר | DiaMed | AD15MLP-S | |
| בקבוקי סרום, נפח 125 mL | חומר | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
| מזרק, 60 mL | חומר | BD Biosciences | 309653 |
מקורות
- Neufeld, J. D. DNA stable-isotope probing. Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).
- Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a t....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
