מיקרוסקופיה מולקולה בודדת approch סיפק תובנות הרומן לתוך התחבורה גרעיני.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
השירות של מולקולה אחת הגישות פלואורסצנציה מיקרוסקופ הוכח להיות הצלחה גדולה בהבנת תגובות ביולוגיות בעשור האחרון. החקירה של אינטראקציות מולקולריות עם רזולוציות של זמן ומרחב גבוהה עמוק בתוך התאים נותר מאתגר בשל אותות חלשים מטבעם הנובעים מולקולות בודדות. עובד לאחרונה על ידי יאנג et al. הראו כי צר שדה מיקרוסקופיה epifluorescence מאפשר הדמיה של תחבורה nucleocytoplasmic ברמת מולקולה בודדת. לפי הגישה מולקולה בודדת, קינטיקה חשובים, כגון זמן תחבורה יעילות גרעיני, על מולקולות מטען אות תלויים ובלתי תלויים הושגו. כאן אנו תיאר פרוטוקול הגישה המתודולוגית עם רזולוציה spatiotemporal משופרת של 0.4 ms ו -12 ננומטר. ברזולוציה משופרת אפשרה לנו ללכוד תחבורה פעילה חולף ואירועים דיפוזיה סבילה דרך מתחמי נקבוביות הגרעין (NPC) למחצה תאים שלמים. אנו מצפים כי בשיטה זו כדי לשמש הבהרת אירועים מחייב סחר אחרות בתוך התאים.
פרוטוקול
1. הכנת מערכת התא לצורך הניסוי מולקולה בודדת
- לפחות שבוע מראש, להתחיל תרבות חדשה של קו תא הלה מן המלאי על ידי הפשרת ב 37 ° C ו לשים בקבוקון 25 2 ס"מ תרבות עם 5 מ"ל התקשורת, דגירה התאים ב 37 מעלות בתוך 5% CO 2 החממה למשך 24 שעות ו לפצל אותו לפחות 3 פעמים על מנת לספק תנאי אופטימלי עבור התאים. עם זאת התאים לא אמור להיות מפוצל יותר מ 20 פעמים בשל נטייה של קצב הצמיחה שלהם להאט באופן משמעותי. תאים הלה היו בעבר מהונדסים גנטית יש GFP (חלבון הפלואורסצנט הירוק) התמזגו חלבון קרום הגרעין נקבוביות המעטפה פום 121. זה הכרחי עבור לוק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
יש להקפיד על מנת להבטיח colocalization התקין של מולקולות NE חד במהלך הניסוי. חשוב גם לתת יחס אות לרעש גבוה, במיוחד כאשר האות הוא נמוך בשל תיוג עניים או photobleaching. דיוק לוקליזציה היא מוגבלת על ידי רעש רקע (הנובעים out-of-להתמקד הקרינה, רעש CCD readout, גורמים אחרים הנוכחי כהה).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
פרויקט זה נתמך על ידי שיפור יכולת המחקר גרנט (באולינג גרין סטייט).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מקורות
- Ma, J., Yang, W. Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Forthcoming (2010).
- Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. Single Molecule Imaging of the Calci....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
