קביעת מספר נייד במהלך תרבית תאים באמצעות מונה Cell שרביט השלטון

סיכום

מונה Cell שרביט השלטון הוא מכשיר כף יד אוטומטיים שניתן להשתמש בהם כדי לספור תאים, צג בקוטר של התא נפח לשמש כדי לבדוק את בריאות ואיכות הסלולר אוכלוסיות מתרבות אחת לאחרת.

תקציר

ספירת התאים לרוב צעד הכרחי אך מייגע על התרבות תאים במבחנה. ריכוזים תא עקבי להבטיח שחזור דיוק ניסיוני. ספירת תאים חשובים לניטור תקינות התא קצב התפשטות, להערכת הנצחה או טרנספורמציה, זריעת תאים transfection, בניסויים הבאים או זיהום, והכנה לקראת מבחני מבוססי תאים. חשוב כי ספירת התאים להיות מדויק, עקבי, ומהר, במיוחד עבור מדידות כמותיות של התגובות הסלולר.

למרות הצורך הזה המהירות והדיוק בספירת התאים, 71% מכלל 400 חוקרים שנסקרו ¹ אשר לספור תאים באמצעות hemocytometer. בעוד hemocytometry הוא זול, זה מייגע ובכפוף הטיה משתמש לרעה, שתוצאתה ספירות מדויקות. Hemocytometers עשויים זכוכית אופטית מיוחדת אשר השעיות תא נטענים בכמויות שצוינו וספר תחת מיקרוסקופ. מקורות שגיאות hemocytometry כוללים: חלוקת התא אחידות במדגם, יותר מדי או מעט מדי תאים במדגם, החלטות סובייקטיבית, אם תא נתון נופל בתוך השטח שהוגדר הספירה, זיהום hemocytometer, המשתמש אל המשתמש וריאציה ו וריאציה של hemocytometer מילוי שיעור ^2.

כדי להקל על השעמום הקשורים לספור ידני, 29% מכלל החוקרים לספור תאים באמצעות תא ספירה אוטומטיות התקנים; אלה כוללות מבוססות ראיה דלפקים, מערכות לזהות תאים באמצעות עקרון קולטר, או cytometry זרימה ^1. עבור רוב החוקרים, המכשול העיקרי באמצעות מערכת אוטומטית הוא המחיר הקשורים benchtop אלה מכשירים גדולים ^1.

מונה תא שרביט השלטון הוא מכשיר כף יד אוטומטית מציעה אוטומציה הדיוק של הספירה קולטר במחיר נמוך יחסית. המערכת מעסיקה את העיקרון של גילוי קולטר עכבה מבוססי החלקיקים ³ בפורמט מיניאטורי באמצעות שילוב של חומרה אנלוגי ודיגיטלי עבור חישה, עיבוד אותות, אחסון נתונים, תצוגה גרפית. טיפ הפנויה מתוכנן עם אזור microfabricated תא חישה, המאפשר אפליה על ידי גודל התא ונפח התא תת מיקרון ותת picoliter החלטה. משופרים עם הנוזל טיפול ערוצי דיוק אלקטרוניקה, הדלפק תא שרביט השלטון דוחות האוכלוסייה תא הסטטיסטיקה מוצגים בצורה גרפית כמו היסטוגרמה.

פרוטוקול

1. חשיבותה של ספירת Cell

1. ספירת התאים הוא צעד הכרחי אך מייגע עבור התרבות תאים במבחנה.
2. ריכוזים תא עקבי להבטיח שחזור דיוק ניסיוני.
3. ספירת תאים חשובים לניטור תקינות התא קצב התפשטות, להערכת הנצחה או טרנספורמציה, זריעת תאים transfection, בניסויים הבאים או זיהום, והכנה לקראת מבחני מבוססי תאים.
4. למרות הצורך המהירות והדיוק בספירת התאים, 71% של 400 חוקרים שנסקרו לספור תאים באמצעות hemocytometer. בעוד hemocytometry הוא זול, זה מייגע ובכפוף הטיה משתמש לרעה, שתוצאתה ספירות מדויקות.
5. מקורות שגיאה hemocytometry כוללים: חלוקת התא אחידות במדגם, יותר מדי או מעט מדי תאים במדגם, החלטות סובייקטיבית, אם תא נתון נופל בתוך השטח שהוגדר הספירה, זיהום hemocytometer, המשתמש אל המשתמש וריאציה ו וריאציה של קצב hemocytometer מילוי.
6. כדי להקל על השעמום הקשורים לספור ידני, 29% מכלל החוקרים לספור תאים באמצעות מכשירים אוטומטיים תא הספירה. עם זאת, עבור רוב החוקרים, מחיר הקשורים אלה הספסל העליון מכשירים גדולים היא מחסום להשתמש שלהם.
7. מונה תא שרביט השלטון הוא מכשיר כף יד אוטומטית מציעה אוטומציה הדיוק של הספירה קולטר במחיר נמוך יחסית.
8. המערכת מעסיקה את העיקרון של גילוי קולטר עכבה מבוססי החלקיקים בפורמט מיניאטורי באמצעות שילוב של חומרה אנלוגי ודיגיטלי עבור חישה, עיבוד אותות, אחסון נתונים, וכן תצוגה גרפית.
9. החיישן הפנויה מתוכנן עם אזור microfabricated תא חישה, המאפשרת אפליה לפי גודל התא, נפח תא בבית תת מיקרון ותת picoliter החלטה.
10. משופרים עם הנוזל טיפול ערוצי דיוק אלקטרוניקה, הדלפק תא שרביט השלטון גרפית מציג האוכלוסייה הסטטיסטיקה תא כמו היסטוגרמה.

2. הכנת מתלה יחיד תא עבור ספירת

1. כדי להשתמש הדלפק תא שרביט, להתחיל לדלל השעיה תא בודד של תאים, פוספט שנאגרו מלוחים. ריכוז של 10,000-500,000 תאים לכל מ"ל הוא אופטימלי.
2. העברת 100 μL של תאים בדילול לצינור mL 1.5 microfuge.

3. ביצוע ספירת תאים באמצעות את שרביט

1. הפוך על הדלפק תא שרביט השלטון על ידי לחיצה ארוכה על מתג בצד האחורי של המכשיר ולחכות ההוראות שעל המסך יופיע.
2. כאשר תתבקש, לצרף חיישן לסוף יחידה את שרביט עם פאנל האלקטרודה חישה הפונים לעבר החלק הקדמי של המכשיר.
3. חיישנים שרביט מורכב תא יצוק דיוק הדגימה, עם אזור חישה אלקטרוניים משולבים תא חישה אלקטרודות. החיישנים מאפשרים להפלות גודל התא בכל תת מיקרון רזולוציה, נפח תא ברזולוציה משנה picoliter.
4. הנדסה חיישן עקבי, מבטיח כרכים מדגם שווה נספרים מדידות גודל מדויק נעשים.
5. לאחר החיישן מחוברת, לבצע כל שלב של תהליך ספירת על פי ההוראות המופיעות על המסך כדלקמן:
6. כאשר המסך קורא "החזק את הבוכנה להתחיל," לוחץ על המתג. המסך אז יהיה לקרוא "להטביע את החיישן." להטביע את החיישן לתוך הפתרון ההשעיה התא ולשחרר את הבוכנה כדי לשאוב את ההשעיה התא לתוך החיישן.
7. הבוכנה משמשת האות החשמלי ו ימשוך את המדגם בתוספת נפח מת לתוך החיישן. המהירות או הדיוק של צולל לא משנה כפי שהיא עושה עם pipetting. תהליך זה יקח כמה שניות. כאשר מוכן, המכשיר יצפצף, ו "לדוגמה טעון" יוצג על המסך.
8. לאחר המדגם הוא נטען לתוך החיישן הוא נמשך דרך אזור חישה להעריך גודל התא ונפח תא, אז דרך microchannels. לאחר 50 μL המדגם נספר חיישן מספרת את המכשיר כדי להפסיק לספור.
9. לאחר ספירת תושלם, המסך של המכשיר יקרא "הרוזן השלם. הסר חיישן וזורקים". בצע את הפקודה, ולהסיר ולסלק את החיישן.
10. המכשיר לאחר מכן להציג היסטוגרמה של גודל התא או קוטר על המסך שלה, כמו גם את ריכוז התאים לכל מ"ל.

4. ניתוח נתונים

1. לאחר הספירה הוא להשלים את ההיסטוגרמה מוצגת על המכשיר, להחיל השערים על ידי לחיצת כפתור לעבור. בחר "gating אוטומטי" או "שימוש אחרון" או כדי להגדיר באופן אוטומטי את השער מבוסס על הפרופיל היסטוגרמה, או להשתמש השערים מהסכום הקודם.
2. בלי קשר הבחירה, השערים ניתן להעביר באופן ידני כדי לכוונן את הנתונים. לחצו על הכפתור לעבור שוב כדי לבחור את השער השמאלי כדי לגלולggle לעבור את השער כרצונכם.
3. ואז ללחוץ על לעבור שוב כדי להפעיל את השער הנכון המגילה לעבור למקום את השער הנכון. לחץ שוב; תא חדש הריכוז הממוצע נפח תא בקוטר יוצג.
4. ניתן גם לעבור לגור צד להחליף את התצוגה בין התאריך, השעה, כלומר גודל התא, כלומר נפח התא.
5. עד 72 היסטוגרמות יכול להיות מאוחסן על המכשיר עצמו. כדי להעלות את הנתונים למחשב אישי, לצרף את המכשיר דרך יציאת כבל ה-USB על מסך התצוגה.
6. במחשב, לחיצה כפולה על יישום התוכנה שרביט השלטון כדי להפעיל את התוכנה ואז ללחוץ על "חיבור". ספירת הכל באופן אוטומטי יציאת התוכנה.
7. תוכנת היישום מציג את שרביט השלטון היסטוגרמה המפרט את התפלגות האוכלוסייה של התרבות בנפח או קוטר. קבצים שהורדו לאחר מכן ניתן לייצא ל-Microsoft Excel, שם את הנתונים הגולמיים יוצג פחי בקטרים ​​של התא שצוין או אמצעי אחסון נייד.

5. נציג תוצאות

1. תשע עשרה שורות תאים שונות מוכנים לספור ריכוזי החל תיאורטי נקבעו באמצעות מונה קולטר. המתלים האלה התא היו אז מדולל יותר כדי להשיג השעיות התא בריכוזים התא התיאורטי.
2. נגד התא שרביט השלטון היה אז בשימוש כדי לקבוע ריכוזי התא. איור 1 מציג 5 דילולים כי נמדדו 5 שורות תאים נציג יחד עם ריכוז התא התיאורטי.
3. רמה גבוהה של ליניאריות כפי שצוין על ידי ערכי R2, מוכיח כי ספירת שרביט השלטון היא שיטה אמינה של שורות תאים שנבדקו, על פני מגוון רחב ההפעלה ליניארי.
4. הדיוק היחסי הכולל של ספירת שרביט השלטון לידי ביטוי באיור 2, שבו נתונים המתקבלים ספירת שרביט השלטון מושווים עם ספירת המתקבל ספירת קולטר.
5. יומן של ספירת שרביט השלטון התא זממו נגד ביומן של ספירת קולטר, מראה כי, בכל שורות תאים שנבדקו, ספירת שרביט השלטון להתאים ספירת קולטר.
6. ספירת של 19 שורות תאים בוצעו באמצעות קולטר Z2 מונה, המונה תא שרביט, מונה מבוסס חזון אוטומטי כגון סלולרי וי או מערכת אינספור, וגם hemocytemeter.
7. ספירת בוצעו על פי הוראות היצרן, תוך שימוש באותו התא החל ההשעיה ו דילולים זהה. התוצאות באיור 3 מראות כי ריכוז התאים נמדד על ידי ספירת שרביט השלטון מקרוב להתאים ריכוזי תא תיאורטי עם ליניאריות גבוהה.
8. מקדם אחוז וריאציה, או קורות חיים, חושבה עבור כל דילול של כל שורה תא עבור כל מערכת הספירה. איור 4 מראה את קורות% בממוצע על פני 19 שורות תאים ביחס ריכוז התא שיטת הספירה.
9. בטווח ההפעלה, הדלפק תא שרביט השלטון מדויקת יותר לספור hemocytometer מבוסס חזון, הצגת סטיות תקן קטנות מקדמי הממוצע קטן יותר של וריאציה.
10. ספירת שרביט פי עשרה מהר יותר ומהר יותר hemocytometry דלפקי אוטומטיות אחרות. ב איור 5, SF9, MCF7, ו HEK293 תאים נספרו בשיטות המתוארות וידאו.
11. הזמן הממוצע הנדרש כדי למדוד את ריכוז התאים נרשם. שים לב hemocytometry בוצע פעם אחת בלבד לכל המדגם.
12. שרביט עושה מדידות על בסיס גודל התא. לפיכך שינויים במורפולוגיה הסלולר ניתן ללכוד בהיסטוגרמה. תרבויות בריא להציג פעמון גאוס נחמד בצורת ההפצה, בעוד תאים בריאים, lyse, ולגרום לשינוי בהיסטוגרמה שמאלה (איור 6, פאנל משמאל).
13. באופן דומה, כאשר אוכלוסיה של תאים מתים 50% היו מעורבים עם תאים חיים 50%, משמרות היסטוגרמה נצפו גם (איור 6, פאנל מימין).

דיון

השוואת הביצועים של הדלפק תא שרביט השלטון על תוצאות שיטות ספירה אחרות, אנו מסיקים כי הנגד החדש כף יד, תא אוטומטי מספקת ספירת תא מדויק, מהיר, אמין על פני טווח רחב ההפעלה. הפונקציונליות של ספירת שרביט השלטון היא תוצאה של הטכנולוגיה דיוק מהונדסים מוטבע קצה החיישן ואת מכשור מתוחכם ספירת המבוסס על העיקרון קולטר. איכות הביצועים עולה שרביט השלטון בספירת כשיטה כדי להגדיל את המהירות ולשפר את שחזור של תא המבוססת על מבחני. הפורמט מאפשר שעמום כף יד ימין ספירה מהירה חינם למכסה המנוע תרבית תאים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חומר שם	חברה	מספר קטלוגי	הערה
שרביט 2.0 מונה כף יד סלולריים אוטומטי עם 40 חיישנים שרביט השלטון מיקרומטר	EMD Millipore	PHCC20040
שרביט 2.0 מונה כף יד סלולריים אוטומטי עם 60 חיישנים שרביט השלטון מיקרומטר	EMD Millipore	PHCC20060
שרביט חיישנים, 60 מיקרומטר	EMD Millipore	PHCC60050	50 חבילות של חיישנים
שרביט חיישנים, 40 מיקרומטר	EMD Millipore	PHCC40050	50 חבילות של חיישנים
מתאם מתח אוניברסלי	EMD Millipore	PHCCPOWER
שרביט O-Ring Kit	EMD Millipore	PHCCOCLIP	2 טבעות אטימה ואחד לכסות מסנן