פפטידים מהספרייה תצוגה phage לווסת את ביטוי הגנים בתאים mesenchymal ו להגביר Osteogenesis ב פגמים עצם Unicortical

סיכום

ספריה התצוגה phage שימש לזהות רצפי פפטיד כי עצם היעד. המטרה היתה לחקור את ההשפעה של פפטידים אלו על התמיינות תאים mesenchymal ולקבוע את השפעתם על התחדשות העצם.

תקציר

שני פפטידים סינתטיים הרומן להאיץ היווצרות העצם ניתן לשלוח באמצעות מטריצת קולגן. מטרת המחקר הנוכחי הייתה לבדוק את ההשפעות על תיקון עצם במודל פגם unicortical. טיפול בתאי mesenchymal המיוצר עלייה בפעילות phosphatase אלקליין, הראה היווצרות גולה על ידי התאים, והגדילה את הביטוי של גנים עבור runx2, osterix, עצם sialoprotein ו osteocalcin. ספוג קולגן ספוגה לתקן קידם פפטיד של פגמים העצם, ואילו השליטה היה פחות יעיל. התוצאות ממחקר זה הראה כי תאים שטופלו mesenchymal פפטיד במבחנה להבדיל כלפי osteogenesis, וכן, כי פפטידים נמסר in vivo באמצעות ספוג קולגן לקדם את תיקון הליקויים unicortical.

פרוטוקול

1. Vivo Biopanning לבודד phage כי היעד העצמות הארוכות

Phage היה רצף ה-DNA ו - פפטידים עם רצף המקביל היו מסונתז. פפטידים היו מסונתז מקשר עם גלאי, גלאי, גלאי-ser-ליזין (והמקשר יש צורך chromophores הזוג פלורסנט המסייעים לעקוב אחר / עקבות פפטידים).

1. בן 10 בשבוע Balb / c העכבר היה מחוסן, לב נחשף.
2. -12 Ph.D התצוגה phage פפטיד ספריה Kit (ניו אינגלנד Biolabs, בוורלי, MA) שימש in vivo biopanning, 10 x 1010 pfu, והזריקו לתוך הלב.
3. לאחר כ 5 דקות, העכבר היה מורדמים. עצמות הירך נחשפו גזור, את הקצוות של עצמות הירך היו מנותקים, ואת מח העצם הוסרה.
4. בתוך ומחוץ של עצם הירך השמאלית היו שטופים 10 פעמים עם PBS, ואת עצם הירך נוספה ER2537 חיידקים (המכונה phage הלא eluted, דלג לשלב 6).
5. התעלה intramedullary של עצם הירך הימנית שטפה עם 2%, חלב רזה מיובש בתוך מזרק עם מחט 21-מד עשר פעמים כדי להסיר שאינם קשורים phage. Phage Bound היה eluted מהתעלה intramedullary עם HCl-גליצין חיץ pH 2.2, לנטרל עם 1M טריס, הוסיף ER2537 חיידקים, בתרבית במשך 4.5 שעות כדי להגביר את phage (המכונה eluted).
6. חיידקים הוסרו על ידי שקיעה צנטריפוגלי של 10 דקות ב 4 ° C, ו phage היה זירז לילה על ידי תוספת של פתרון PEG / NaCl ב 4 מעלות צלזיוס. Phage נאסף על ידי צנטריפוגה ו מושעה זירז פעמיים על ידי תוספת של נפח 1 / 6 של PEG / NaCl. גלולה הסופי היה resuspended ב TBS עם NaN3 0.02%.
7. Eluates מוגבר של הפאג הן eluted ולא eluted הוזרקו לעכברים נפרד, phage היה מבודד לעיל. רק עצם הירך השמאלית הוסרה מן העכבר כי הזריקו phage הלא eluted, ואת עצם הירך ממוקם ישירות לתוך החיידקים (ראה שלב 4 לעיל). עכבר phage eluted היה מבודד רק עצם הירך הימנית ואת phage שפורסמו על ידי HCl-גליצין חיץ לפני הוספת החיידקים (ראה שלב 5 לעיל).
8. זה בהליך biopanning vivo חזר על עצמו שלוש פעמים לפני רצף של דנ"א באמצעות-98 פריימר (המסופק עם ערכת התצוגה phage).
9. Phage משולב היו מוגבר בתרבויות חיידקי, מטוהרים, ונרשמת ולאחר מכן הוזרקו בעכבר הרביעי. סידור חזר על עצמו.
10. כדי להדגים סגוליות פפטיד עצמות מח, phage eluted מן הכליות והכבד נותחו כמתואר לעיל. בכל ארבעה סיבובים היה סכום קטן של הפאג ממוקם האיברים האלה (פחות מ 10%).
11. פפטידים היו מסונתז עם רצף גלאי, גלאי, גלאי-ser-ליס, עם או בלי ביוטין לשמש התא מכתים רקמות, כמו גם עבור עבודה vivo.

2. Cell תרבות mesenchymal לניסויים Osteogenic התמיינות תאים

1. שורת תאים משובטים pluripotential עכבר מח עצם stroma (D1) מבודדים במעבדה שלנו ¹ שימש בניסויים במבחנה. התאים היו בתרבית בינוני שונה של Dulbecco חיוני, DMEM, גלוקוז נמוכה (חתול Gibco # 11885-084) בתוספת 10% בסרום שור העובר (Gibco חתול # 16000-044), חמישים מיליגרם של נתרן ascorbate למיליליטר (Sigma חתול # A7631 ), ו 100 U / mL פניצילין G ו 100 מ"ג / מ"ל ​​סטרפטומיצין (חתול Gibco # 15140-122).
2. תרבויות נשמרו על 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified של 5% CO ₂ חממות מים במעיל ותת בתרבית תאים היו עד כ 90% ומחוברות.
3. Cell היו trypsinized, centrifuged כדי גלולה, לספור, seeded בריכוז של 5x10 ³ תאים / ס"מ ² בתרבות רקמה שטופלו plasticware.

3. מכתים פפטיד עבור תאים ורקמות Cultured

1. D1 או תאים במח היו מצופה על תא פיברונקטין או ג'לטין מצופים היטב שקופיות המכילה DMEM ו -10% בסרום שור עוברי למשך 24 שעות.
2. תאים נשטפו עם PBS. תאים / רקמות תוקנו עם paraformaldehyde 4% במשך 30 דקות
3. אלדהיד עודף נחסמו באמצעות 0.5 M גליצין (pH 7.5) במשך 10 דקות.
4. אנדוגני avidin ו ביוטין הקולטנים על פני התא היה חסום על ידי תוספת של 5% פתרון BSA Avidin + חסימה עבור 1 שעה, לשטוף עם PBS פעם במשך 5 דקות, ואז חסמו במשך שעה 1 עם 5% פתרון BSA ביוטין + חוסם.
5. אז 100 מיקרומטר biotinylated L7 ופפטידים R1 נוספו בארות במשך 30 דקות.
6. תאים נשטפו שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות בכל 1:1000 דילול של אלקסה קמח streptavidin נוספה מודגרות בחושך במשך 30 דקות.
7. תאים נשטפו ו coverslips רכוב עם התקשורת vectashield הרכבה ובחן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

4. Phosphatase אלקליין פעילות Assay

1. Alkaline phosphatase גassay olorimetric בוצעה על monolayers באמצעות ערכת phosphatase אלקליין (BioRad) מומלץ על ידי היצרן.
2. התאים D1 היו מצופה בצפיפות 5 x 10 תאים ³ / ² ס"מ על 6 צלחות היטב בתרבות שטופלו R1 פפטיד, פעילות ALP היה לכמת ב 4 ימים, 8, 12, 16 ו -20.
3. כדי להכין את lysates תא, תא שכבות נשטפו שלוש פעמים עם PBS חיץ ואז התחככו PBS ואחריו sonication ו צנטריפוגה להסיר פסולת הסלולר.
4. כמויות שוות של lysate (100 μL) היה מעורב אז עם 100 μL של המצע colorimetric מוכן טרי para-nitrophenyl פוספט, וטופחו על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
5. התגובה האנזימטית הופסק על ידי הוספת 100 μL של 0.2 N NaOH פתרונות. פעילות ALP נמדדה ב 405 ננומטר באמצעות ELISA הקורא (Bio-Rad).
6. ריכוז חלבון של התא lysates נמדדה עם ערכת חלבון BioRad Assay ופעילות AP התבטא אז nitrophenol-para המיוצר nmol / דקות / מ"ג חלבון.
7. פעילות ALP חושבה על פי הוראות היצרן (Sigma, Inc).
8. יחידות של פעילות ALP היו מנורמל ל מיליגרם של תכולת החלבון הכולל עם BCA assay (פירס, Rockford, IL) של lysate התא.

5. התמיינות תאים mesenchymal באמצעות L7 ו R1

1. Subconfluent mesenchymal (D1) התאים גדלו ל כ 90% confluency ו שטופלו 5nm L7 ו פפטיד R1.
2. תאים נקצרו ב 0.5, 2, 6, 24 ו - 48 שעות, ו-RNA הוכן באמצעות ערכת RNeasy Qiagen באמצעות ההוראות של היצרן.
3. Reverse transcriptase (RT) התגובות היו annealed (37 ° C, 10 דקות) ואחריו סינתזת הגדיל הראשון cDNA (42 ° C, 30 דקות) איון חום (95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות). CDNA וכתוצאה מכך היה מאוחסן קפוא (-70 ° C) עד assayed על ידי ה-PCR בזמן אמת.
4. זמן אמת PCR בוצעה באמצעות SYBR QuantiTect גרין PCR Kit (Qiagen). התגובות בוצעו עם 25 μL של תמהיל גרין מאסטר ערכת SYBR ואת קדימה primers הפוכה (300 nmol / L) של גנים ספציפיים על עצם Runx2 למשל, Osterix, osteocalcin, sialoprotein העצם, גנים מסלול ה-Wnt כמו ב-catenin, LRP6, 5a 7b Wnt, 10b, DKK1 ו OPG ו RANKL (ראה לוח 1).
5. ΜL 3 מדגם cDNA נוספה התגובה התערובת הסופית חי מן התגובה RT. 96, גם בזמן אמת בפורמט PCR כלל שישה 10 פי דילולים בשני עותקים של תקני ה-DNA פלסמיד. בארות הצלחת נחתמו עם מכסה דבק אופטי (BioRad) ו centrifuged במהירות נמוכה (300 גרם, 5 דקות) כדי להבטיח ערבוב מלא.
6. מדגם כל נותח לפחות כפול עם המכשיר iCycler (BioRad מעבדות, הרקולס, CA).
7. הפרוטוקולים PCR בשימוש מעורב ההפעלה של ה-DNA פולימראז זהב AmpliTaq ואחריו 40 מחזורים של denaturation על 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, חישול בטמפרטורה המתאימה עבור 30 שניות, הארכה על 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. מחזור מספר סף PCR (CT) למדגם חושבה בנקודה שבה הקרינה מהמגבלה המותרת הסף. מגבלת סף היה קבוע לאורך בשלב לוגריתמי ליניארי של עקומי הקרינה ב 10-20 סטיות תקן (SDS) מעל פלואורסצנציה הרקע הממוצע. משוואות עקומת תקן חושבו על ידי ניתוח רגרסיה לממוצע של ה-CT לעומת LOG10 של קרוב cDNA להציג את RNA מוחלט. הביטוי היחסי של הגנים היעד היה מנורמל ל 18S עבור גנים ספציפיים העצם ב-אקטין שימש הגן מסלול ה-Wnt.

6. כהכנה vivo של Gelfoam Composite

1. באמצעות שגרות aseptic, gelfoam צילינדרים (Pharmacia & Upjohn חתול # 09-0353-01), 3 מ"מ קוטר 8 מ"מ אורך, נוצרו באמצעות מכשיר מעוצב עצמית.
2. עשרים וארבע שעות לפני הניתוח, הגלילים gelfoam היו להשרות טעון עם או L7 או R1 פפטיד (20 מיקרומטר PBS) או חיץ PBS ללא פפטיד. גלילים gelfoam הועברו 12 מנות סטרילי תרבות היטב מאוחסנים ולינה -4 ° C.
3. בזמן הניתוח, מורכב gelfoam במנות תרבות הועברו מהמקרר ולשים על הקרח עד הניתוח.

7. עצם פגמים

1. הנהלים כל חיה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת השתמש מערכת הבריאות של אוניברסיטת וירג'יניה, לפני מתבצע. עשר תשעה חודשים בן זכר בוגר syngeneic פישר 344 חולדות (350-400 גרם) היו intraperitoneally הרדים בתערובת של קטמין (50 גרם לכל גרם משקל גוף) ו xylazine (5 גרם לכל גרם משקל גוף).
2. גישה ניתוחית דו נעשתה להיבט anteromedial של השוקה. חולדות בגיל זה ומעלה להראות עליות משמעותי באזור החתך, אזור בקליפת המוח עצם, מסת העצם, צפיפות העצם, אורך צירית של anteromediaאני היבט של השוקה. פגם גדול, unicortical נוצר מלבן אשר נמדד על ידי 3 מ"מ רוחב 8 מ"מ ארוך באמצעות Burr פנאומטיים (מקדחה הול מהירות גבוהה; צימר) תחת השקיה מליחים.
3. פגם העצם טופלה gelfoam עם או בלי פפטידים. פיגומים כל מושתל, מדידת רוחב 3 מ"מ לפי אורך 8 מ"מ על ידי עומק 1.5 מ"מ, הוכנסו על ידי לחיצה עדינה. קיבעון מכשירים חיצוניים או פנימיים לא איבר שימשו לאחר הניתוח, חיות מותר ambulate ללא הגבלה מיד לאחר הניתוח.

8. היסטולוגיה ו Morphometry

התחדשות העצם הוערך על ידי המורפולוגיה הגולמי תמונות דיגיטליות שצולמו.

1. החולדות היו מורדמים ואת tibias נאספו בבית 3, 5, ו - 12 שבועות כדי לכמת את כמות העצם החדש שנוצר בעקבות פציעה.
2. לאחר בדיקת פגם עצם בקפידה, השוקה שנקטפו היו קבועים 10% נייטרלי שנאגרו פורמלין, decalcified ב RDO decalcifier מהירה במשך 72 שעות, ולאחר מכן מעובד שגרתי מוטבע פרפין, ו מחולק longitudinally.
3. התחדשות העצם הוערך על ידי בדיקה מיקרוסקופית ברוטו ואור.
4. עשרת החיות שימשו כל תנאי (כלומר, פגם ריק, gelfoam לבד, gelfoam פלוס R1 פפטיד). פגם 8mm unicortical היה מיוצג על פני ~ 40 סעיפים רקמות, שכל אחד מהם היה 8 מיקרומטר עבה. מבין 40 הסעיפים, השתמשנו מינימום של 6 חלקים לכמת את כמות עצם חדשה.
5. כל קטעי הרקמה הוכתמו hematoxylin / eosin (H & E), אשר תוויות מטריצה ​​דמוי עצם.
6. שקופיות כל הוערכו על ידי מיקרוסקופית.

9. עצם תיקון

סקירה

תיקון העצם הוא בבירור אזור חשוב מאוד של שיקול בתחום של התחדשות רקמות שריר ושלד. פפטידים כי עצם היעד יכול להיות כלי משמעותי בפועל של ניתוח אורתופדי, בעיקר בשימוש protheses שניתן שכינת שנים אם לא עשורים. המאפיינים biomimetic גורמים טרופי העצם עלול ליצור צעד קדימה טכנולוגיים בתחום הנדסת רקמות, כמו גם לניתוח תותבת של העצם. הכללה של עצם המיקוד גורמים פולימרים סינתטיים או טבעיים עשויים לסייע הספציפיות של היצמדות התא, ובכך הדחה אנדוגני בתוך התאים והרקמות, כי הם עוברים תיקון והתחדשות. מטרה נוספת היתה להקים אם עצם הייחודית שלנו המיקוד פפטידים שזוהו על ידי in vivo biopanning של ספריה התצוגה phage היה להיקשר לתאי מבודד עצם מח עצם, ויש להם את הפוטנציאל לווסת osteogenesis במבחנה התחדשות העצם in vivo.

בניסויים שלנו, אנו נשא את פפטידים לתוך פגמים הירך של חולדות באמצעות מטריצות פולימרים טבעיים וסינתטיים התחדשות העצם נבדק על ידי היסטולוגיה, ביוכימיה, ביטוי גנים, מיקרו CT ו ביומכניקה על מנת להבהיר פרטים על פעילות הפפטיד על התחדשות העצם. פיתוח נוסף של גישה זו יכולה להוביל לגילוי ופיתוח של חומרים פעילים ביולוגית כי עצם המטרה להגביר לתקן באמצעות מנגנונים מאופיינים היטב ביולוגית ברמה תאית ומולקולרית.

הכתמה

פפטידים היו מסונתז עם ביוטין, תוויות על מנת לקבוע מחייב לוקליזציה לתאי mesenchymal. והעמסת-isothiocyanate (FITC) שכותרתו avidin שימש מיקרוסקופית למקם את הכריכה של פפטידים על תאים הגדלים במבחנה. פפטידים להיקשר לתאי mesenchymal בתרבות כמו גם עצמות מח ב הצלעות עכבר סעיפים רקמה במבחנה (איור 1).

פון מכתים Kossa

תא mesenchymal (D1) שוכפלה ממח העצם השתמשו כדי לקבוע את ההשפעה של פפטידים osteogenic על תאים במבחנה. התאים טופלו פפטידים L7 ו R1 כדי לקבוע שינויים במורפולוגיה התא ביטוי גנים. באותו יום 4, התאים החלו המצרפי, אגרגטים המוגדל עם הזמן ליצירת גושים, התנהגות התא דפוס דומה לתאי עצם בתרבות (איור 2).

תוספת של הפפטיד L7 או R1 כדי מכתים התאים משופרת של התרבויות עם פון Kossa. תאים שטופלו מכן עם ריכוזים שונים של הפפטיד L7 או R1 עד 16 ימים בתרבות. נקבע כי 5 פפטיד nM היה יעיל ביותר במבחנה. פעילות phosphatase אלקליין בתרבויות כי טופלו פפטיד עלה מ לקפל בין 2 ל 3.5. גידול של פי תלויה בריכוז של הפפטיד ואת הזמן של טיפול בתרבות.

בזמן אמת PCR

תאים שטופלו L7 ופפטידים R1 נותחו באמצעות Real-Time PCR עבור ביטוי גנים לשני ידוע תא עצם גורמי תעתוק (Osterix ו Runx2) ושלושה מטריקס העצם חלבונים (עצם sialoprotein, osteocalcin וסוג קולגן אני). טיפול עם R1 הראו עליות Osterix Runx2 וביטוי גנים. קולגן מסוג 1 ביטוי גנים נותר ללא שינוי. טיפול עם L7 הראו עלייה ביטוי גנים BSP ו osteocalcin כמו גם ביטוי של סוג הגן אני קולגן. זה מוכיח כי גם פפטידים יש השפעה על גנים הקשורים להתפתחות והתקדמות של osteogenesis בתרביות תאים mesenchymal.

הטיפול בתרביות תאים במבחנה עם פפטידים R1 ו-L7 חשף השפעה אנאבולית הקשורים היווצרות העצם באמצעות תאים mesenchymal. גידול בשיעור של osteoprotegerin כדי RANKL מעיד על ירידה בגיוס של תאים resorbing עצם ידועים כמו osteoclasts. טיפול בתאי עם פפטידים מוביל גם לעלייה בביטוי של גנים הקשורים היווצרות העצם פוחתת הגורמים המעכבים osteogenesis.

היסטולוגיה

כדי לקבוע את כמות העצם, חשפנו את פרוסות העצם אור μLtraviolet ובכך לייצר autofluorescence. זה מספק ניגוד גדול יותר בין העצם ולא העצמות ורקמות לצורך quantitation ^2. קטעים שצולמו בשתי בתחום האור האולטרה סגול בהיר (איור 3) ניקון אור אולטרה סגול על ידי מערכת הדמיה דיגיטלית של ניקון בהגדלה זהה (x10 אובייקטיבי). התמונות הדיגיטלי שנוצר נותחו עם Metavue הדמיה תוכנה (התקנים מולקולריים). בחרנו באזור קבוע, מלבני של עניין (ROI) שהכיל את הפגם 8 מ"מ unicortical. האתר פציעה תמיד היה מיוצג על ידי הצבת תיבת ידנית בתנוחה הנכונה על כל תמונה בתוך ההחזר על ההשקעה הזאת. פיקסלים H & E-חיובי היו אוטומטיות בחלקן באמצעות הכלי מטה הקסם מוגדר סובלנות צבע. הגדרה זו סובלנות הביא פיקסלים מודגשת עם מגוון של ירוק תאמו בדיוק עם הופעת היסטולוגית של רקמה גרמית ב H & E מוכתם חלקים. המספר הכולל של H & E-חיובי פיקסלים עבור כל מקטע נרשמה. ספירת פיקסלים של חלקים בודדים היו בממוצע עבור כל דגימה השוקה ואת ההבדלים בתוך ובין קבוצות הטיפול חושבו בהתבסס על הממוצעים האלה. האזורים כל הדגימות היו אז לעומת בהתבסס על כמות של קליפת העצם החדש (איור 4).

נוכחותו של עצם בסעיפים היה לכמת לקבוע לתקן עצם הליקויים שטופלו פפטיד + gelfoam בהשוואה gelfoam לבד. פגמים אשר היו מלאים gelfoam + R1 הפפטיד הראה את הכמות הגדולה ביותר של קליפת המוח לתקן עם 10, 7 ו -2 פי להגדיל ב 3, 5, 12 שבועות בהתאמה. ההבדלים לתקן עצם קורטיקלי ב gelfoam + פפטיד לעומת gelfoam לבד היו הבולט ביותר ב 3 ו 5 שבועות הוכחת כי הפפטיד מקדם התחדשות העצם קליפת המוח (איור 5).

10. אפקט אנאבוליים של פפטידים Osteogenic

יחס OPG / RANKL גדול ביחס RANKL / OPG, אשר טוען כי פפטידים עשויה להיות השפעה ישירה על osteoblasts ולהסדיר ספיגת העצם.

פפטידים סינתטיים עשויים יתרונות על פני מולקולות גדולות יותר כגון מהירות הכנה, יציבות מולקולרית, חיי מדף ארוכים ויישומים טיפולית פוטנציאלית. התקדמות משמעותית נעשתה מנסה לווסת הפסד התחדשות העצם ועל ידי ציטוקינים השליטה גורמי גדילה. פפטידים אלו עשויים להציע osteotropic חלופות אטרקטיביות לטיפולים הקיימים לעורר אנאבוליזם עצם התחדשות העצם.

באיור 1. פפטיד מחייב מח עצם בסעיף צלע רקמות העכבר במבחנה.

איור 2. תאים mesenchymal (D1) טופס גושים לאחר טיפול הפפטיד.

איור 3. היסטולוגיה של תיקון העצם באמצעות פפטידים osteogenic, L7 ו R1.

איור 4. סעיפים עצם מוכתם H & E תחת אור UV אשר גורמת autofluorescence. זה מספק ניגוד גדול יותר בין העצם ולא העצמות ורקמות לצרכי quantitation.

איור 5. Quantitation העצם בסעיפים היסטולוגיה הראתה את הכמות הגדולה ביותר של תיקון קורטיקליים היה 5 שבועותשינוי של פי 10, 7 ו -2 פי 3 ב ו 5 שבועות הוכחת כי הפפטיד מקדם התחדשות העצם קליפת המוח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת ספריית פפטידים של תצוגת פאג'ים-Ph.D-12	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	E8110S