טיהור יעיל של ה-DNA פלסמיד מתרבויות פרוקריוטים

סיכום

פרוטוקול זה הוא חלופה חסכונית הבהרה במקביל יעילה לטיהור פלסמיד דנ"א מ א coli תרבויות. תהליך מתקדם AcroPrep מתחיל עם צלחת הבהרה אופטימיזציה lysate מסנן ואחריו טיהור על צלחת קיבולת גבוהה מחייב DNA לסנן מחייב.

תקציר

אנו מתארים את תהליך שלם של צלחות AcroPrep מתקדם סינון עבור 96 ההכנות פלסמיד, החל בתרבות פרוקריוטים וכלה DNA הטוהר גבוהה. בהתבסס על הסינון רב גם לקבלת אישור lysate חיידקי וטיהור DNA, שיטה זו יוצרת תהליך יעיל להכנת הפלסמיד. צלחות סינון המכיל סיליקה מבוסס מדיה יכול בקלות להיות מעובד על ידי צנטריפוגות סינון ואקום או להניב כמות ניכרת של DNA פלסמיד. ניתוח כמותי לקבוע את ה-DNA פלסמיד מטוהרים באופן עקבי באיכות גבוהה עם ממוצע OD _260/280 יחס של 1.97. בסך הכל, התשואות פלסמיד דנ"א טהור להציע יותר עבור יישומים במורד הזרם, כמו רצף השיבוט. שיטה זו יעילה של השימוש צלחות AcroPrep מתקדם סינון מאפשר עיבוד ידני, חצי אוטומטי או אוטומטי מלא.

פרוטוקול

1. Lysate עמילות

1. לגדול E. coli תרבויות טרנספורמציה עם DNA פלסמיד הרצוי צלחות באר עמוקה (1 מ"ל של תרבות / טוב) במרק לוריא עם אנטיביוטיקה מתאימה לילה בשעה 37 ° C עם רעד.
2. גלולה E. coli בצלחת תרבות XG ב 5000 במשך 10 דקות, ולאחר מכן supernatant למזוג.
3. Resuspend כל גלולה ב הצפת 100 Resuspension μL (50 mM טריס-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​RNase A).
4. הוספת 100 הצפת תמוגה μL / היטב (200 mM NaOH, SDS 1%) וללחוץ באמצעות צלחת שייקר במשך 2 דקות.
5. הוספת 100 μL / גם הצפת נטרול (3.0 Acetate M אשלגן, pH 5.5) ולנער במשך 2 דקות.
6. העברת lysate התא lysate צלחת הבהרה.
7. מניחים צלחת DNA מחייבת על גבי צלחת 350 אוסף μL ומקום לתוך התחתון של סעפת ואקום. להרכיב סעפת ואקום (ראה איור 1).
8. Lysate הבהרה צלחת מניחים על גבי מכשיר ואקום.
9. החל ב 10 ואקום בו כספית (0.34 בר) ולאסוף תסנין לתוך הצלחת ה-DNA מחייבת. אין להשתמש ואקום גדול מ 12 פנימה כספית. (0.41 בר).
10. לפרק סעפת ואקום. מקום 2 מ"ל איסוף פסולת צלחת התחתון של המנגנון.

2. איגוד ה-DNA

1. הזז את הצלחת ה-DNA מחייבת לחלק העליון של סעפת (ראה איור 2).
2. הוסף חוצץ 300 μL / עקידת היטב (6 Guanidine M-HCl) ו פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב.
3. החל ואקום [~ 5 פנימה כספית (0.17 בר) עבור ואקום איטי] וזורקים תסנין. DNA הוא עכשיו חייב הממברנה.
4. לשטוף עם μL 400 / הצפת לשטוף היטב (80% אתנול).
5. החל ואקום, ואז להשליך את תסנין. מחק מיותר אם באמצעות 2 אוסף צלחת מ"ל או סינון ישירות פסולת.
6. חזור על לשטוף פעם.
7. כתם התחתון של צלחת לסנן על מגבת סופג לייבוש.
8. החל ואקום שוב למשך 5-10 דקות, כדי להבטיח הסרת אלכוהול שיורית.
9. כתם למטה כדי להבטיח הסרה של טיפות אתנול.

3. ה-DNA elution

1. הוסף 70 μL / גם הצפת elution (10 mM טריס-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA). אם ריכוז ה-DNA גבוה הוא הרצוי, נפח, ניתן להפחית עד 50 μL / היטב, אך את התשואה הכוללת הממוצעת תהיה נמוכה יותר.
2. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.
3. ה-DNA מטוהרים ניתן eluted ידי ואקום או צנטריפוגה.
4. שיטה אבק: מקום איסוף צלחת נקייה (DNase, RNase חינם) לתוך סעפת ואקום. צלחת מניחים לסנן על גבי סעפת ואקום, ואקום להחיל על 15 בו כספית (0.5 בר) לרגע 1 עד כל חיץ elution עבר דרך הצלחת ה-DNA מחייבת. איסוף DNA מטוהרים (ראה איור 3).
5. שיטה צנטריפוגה: טיהור מקום צלחת לסנן על גבי צלחת לאוסף צנטריפוגות נקי XG ב 1000 במשך 5 דקות.

4. ניתוח כמותי ואיכותי

1. מדידת OD _260/280, לחשב ריכוז של DNA מטוהרים.
2. ביצוע ניתוח agarose ג'ל של pDNA מטוהרים.

5. נציג תוצאות

החיידק lysate הבהיר באמצעות צנטריפוגה מסורתיים AcroPrep מל מתקדם lysate הבהרה צלחות סינון הראו הפחתה ניכרת של פסולת חומרי המוצא. (איור 4).

פלסמיד דנ"א בשלושה ריכוזים היה ממוסמר אל TE חיץ עברו את הצלחת lysate הבהרה AcroPrep לסנן מראש. השוואה בין ריכוז ה-DNA פלסמיד, טרום ופוסט סינון, מראה התאוששות ~ 100% (איור 5) בכל שלושת ריכוזי.

כדי להדגים את ההתאוששות של ה-DNA של ה הבהיר coli DNA lysate, הפלסמיד היה ממוסמר אל lysate גולמי הבהיר מכן על ידי סינון. הדנ"א פלסמיד באותו התווסף סינון lysate התא הבא. אלקטרופורזה בוצעה על aliquots מכל מדגם (איור 6). להקה אחת, ברורה של אינטנסיביות דומה מכל מדגם מדגים מעט אם בכלל הפסד DNA במהלך שלב הסינון מבוסס הבהרה.

תרבויות של E. coli המכילים DNA פלסמיד pCAT היו מטוהרים מן E. coli lysates באמצעות 350 של מל μL ו 1 מ"ל מחייב DNA צלחות סינון, כמו גם שני מותגים אחרים של 350 צלחות DNA μL מחייב. Purifications כל בוצעו כמפורט בפרוטוקול המומלץ של היצרן. ריכוז ה-DNA ואת התשואה הגבוהה ביותר הכולל נראים מ 1 מ"ל של מל DNA AcroPrep צלחת מתקדם מסנן טיהור (איור 7 ואת טבלה 2).

למרות מתחרה W מציג גם ריכוז גבוה DNA (155 ng / μL), תשואה DNA הכולל הוא הנמוך ביותר (4.7 מיקרוגרם / טוב) עקב כמות התאוששות נמוך, ~ 30 μL. מתחרה M נתן את הריכוז הנמוך ביותר של ה-DNA ב 108 ng / μL עם תשואה כוללת של 5.6 מיקרוגרם / היטב.

אגרOSE ניתוח בג'ל של דנ"א pCAT מטוהרים מן שלוש צלחות DNA שונה מחייב מוצג באיור 8. כל כרך מדגם שנאסף הותאם μL 65 לתקן הבדלים בנפח התאוששות לפני אלקטרופורזה. כל הדגימות להראות supercoiled DNA פלסמיד, אבל תשואה דנ"א מכל אחד צלחות סינון משתנה.

איור 9 מציג את ה-DNA הוא מוכן לכל צורה supercoiled ויש ריכוז דומה.

באיור 1. האסיפה של סעפת אבק לבירור lysate.

איור 2. האסיפה של סעפת אבק עבור איגוד ה-DNA.

איור 3. האסיפה של סעפת אבק עבור elution אבק.

איור 4. סינון מפשט הבהרה המדגם. בשלושה עותקים דגימות של 300 μL של lysate גולמי הבהיר ידי סינון ואקום (350 AcroPrep μL מתקדם lysate הבהרה צלחת מסנן) או צנטריפוגה המסורתית. OD ₃₂₀ נמדד לפני ואחרי בירור.

איור 5. התאוששות מלאה של pDNA לאחר מעבר דרך lysate AcroPrep צלחת מתקדם הבהרה הסינון. 300 μL חיץ TE מתובל pCAT של 25, 50 ו -100 מיקרוגרם / מ"ל. ריכוז ה-DNA והתאוששות לחשב OD ₂₆₀ לפני ואחרי סינון, N = 2.

איור 6. השחזור של ה-DNA pCAT לאחר בירור. כמויות שוות של pUC19 זינק לתוך lysate לפני או אחרי הבהרה, ולאחר מכן מדולל 1 עד 10 חיץ TE. Loaded 2 μL / מסלול על 1.2% agarose ג'ל.

איור 7. תשואה גבוהה DNA פלסמיד ל-DNA היטב עם Acroprep מתקדם מעטה צלחת לסנן מחייב מאשר צלחות מתחרה. הדנ"א pCAT תשואה פלסמיד (OD ₂₆₀₎ באמצעות דנ"א הצביעו על טיהור צלחות עם מ"ל 1 (מל ו-M מתחרה) או 1.5 מ"ל (מתחרה W) תרבות של לילה DH5α. טיהור באמצעות פרוטוקול מומלץ היצרן צלחת. ברים שגיאה לציין שגיאת התקן (n> 6).

איור 8. Agarose ניתוח בג'ל של דנ"א pCAT מטוהרים על הצלחת ה-DNA הצביע מחייב. 1.2% agarose ג'ל אלקטרופורזה של pDNA מטוהרים. דגימות משולב משלוש purifications נפרדים, eluate מותאם μL 65 אחרי, 1:10 טיהור בדילול מלא. Loaded 2 μL לכל נתיב.

איור 9. איכות ההתאוששות של דנ"א טהור דומה כאשר שיטות צנטריפוגה או ואקום משמשים אלקטרופורזה הסופי אוסף eluate ג'ל agarose של pDNA מטוהרים. פרוטוקול המומלץ של היצרן לקבלת AcroPrep צלחות מתקדם סינון בעקבותיו לטיהור pDNA. Elution בוצע על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 5 דקות או ואקום עם 15 פנימה כספית (0.5 בר) במשך 2 דקות.

דיון

אנו מתארים פרוטוקול קליל, יעיל של סינון צלחות AcroPrep מראש מקנה מספר יתרונות. שיטה זו מספקת מקסימום תשואות DNA פלסמיד כאשר מעובד בפורמטים מתקדם ידניות, חצי אוטומטיות, אוטומטיות או מלא AcroPrep. Prefilter משולב על הצלחת אישור lysate מספק סינון עקבית של דגימות, אפילו אלו המכילים רמות גבוהות של חלקיקים. הגיאומטריה היטב את התוצאות צלחת, שיעורי מהר סינון אחיד יותר על פני צלחת עם נפח לקיים מעקב מינימלי; ואת הגיאומטריה קצה פורקן מספק זרימה ישירה של דגימות לתוך צלחת מקלט בלי חששות של זיהום לחצות. חשוב לציין, קרום קיבולת גבוהה מחייב לוחית DNA המחייב של AcroPrep צלחות מתקדם סינון ממוטב התאוששות מקסימלית של ה-DNA באיכות גבוהה פלסמיד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פלטת סינון AcroPrep Advance	Pall Corporation	PN 8175 (1 mL) או PN 8075 (350 µl)	סיב זכוכית 3 μm וממברנת Supor® 0.2 μm להבהרה
פלטת סינון AcroPrep Advance	Pall Corporation	PN 8132	לקשירת DNA
סעפת ואקום (Vacuum manifold)	Pall Corporation	PN 5017
משאבת ואקום	Pall Corporation	PN 13157