הלבלב Murine איילט בידוד

פרוטוקול

Collagenase הכנה

1. תשקלי את collagenase לתוך חיץ 50 מ"ל בידוד חרוטי ולהוסיף להפוך את הריכוז הסופי, כמפורט בטבלה שלהלן. ממיסים את collagenase ידי vortexing.
   
   
   (12 + 2 עכברים עכברים עכברים תוספת = 14 x 5 מ"ל / עכבר = 70 מ"ל collagenase פתרון מוחלט)
   
   
   (70 מ"ל x 0.5 מ"ג / מ"ל ​​או 0.3 מ"ג / מ"ל ​​= 35 מ"ג או 21 מ"ג בסך P collagenase)
   
   
   

   זן	גיל	Collagenase P (מ"ג / מ"ל)	זמן (דקות)
   C3H, Balb / C, B6	> 12 שבועות	0.8	17
   C3H, Balb / C, B6	<= 12 שבועות	0.5	13
   מהנהנת, NOR, אי	> 12 שבועות	0.8	17
   מהנהנת, NOR, אי	<= 12 שבועות	0.5	17

   
   
   
2. לוותר על 2 מ"ל של תמיסת collagenase לתוך בקבוקון זכוכית בכל מקום על הקרח. טען כל מזרק 5 מ"ל עם 3 מ"ל של מחט collagenase להוסיף 30G מקום בקרח (להכין במנדף).

Distension

1. רגע לפני לנתיחה, להקריב בעלי חיים על ידי נקע בצוואר הרחם. ספריי על כל הגוף עם 70% ETOH, מה שהופך אותו רטוב לגמרי. הפוך V-insision החל באזור אברי המין. סובב את העכבר כך הזנב פונה ממך.
2. הסר את המעי לצדו השמאלי של העכבר פתוח. זה יחשוף את הלבלב צינור המרה המשותף.
3. מניחים מהדק hemostat משני צדי קטן המעי, שם את צינור המרה מנקז, משאיר כיס קטן לפתרון collagenase להזין את המעי.
4. לנפח את הלבלב דרך בצינור המרה עם מחט 30G ו 5 מ"ל במזרק המכיל 3 מ"ל של תמיסת collagenase קר, החל בכיס המרה.
5. הסר את הלבלב מהגוף ולמקם אותו בקבוקון siliconized המכיל 2 מ"ל של תמיסת collagenase. צעד זה צריך להיעשות במהירות ככל נקי ככל האפשר, מזעור אוסף של רקמות שומן החיבור.
6. מניחים את הצנצנת על קרח שלב 3 לחזור עם העכבר הבא.

עיכול

1. חותם כל בקבוקון ולמקם אותו לתוך אמבט 37 ° C-המים. דגירה של 13-17 דקות (הזמן משתנה עם הגיל זן של בעל החיים).
2. לאחר זמן שחלף, לנער את הבקבוקון במרץ. הלבלב צריך להתפרק.
3. יוצקים כל לעכל דרך מסננת כיור גדול סטרילי לתוך מבחנה סטרילית 1000 מ"ל ו - בכוח פיפטה את המסך עם כביסה חיץ. לוותר מעכל לתוך צינורות conicals 50 מ"ל (3 pancreata/50 צינור מ"ל: אם n = 12, השתמש מספיק כביסה חיץ כדי להפוך את סופי 200 מ"ל נפח ומוציאים אותו לצינורות 4x50 מ"ל). דילול צריך להיעשות במהירות על הקרח, כדי למנוע עיכול איון לא רצויות.
4. ספין למטה: הפעל את הצנטריפוגות. כאשר זה מגיע 1300 סל"ד, לכבות אותו.
5. לשאוב supernatant, עוזב ~ 5 מ"ל. היה זהיר מאוד שלא לשאוב את הכדור.
6. Resuspend גלולה ידי הקשה נמרצות עם היד שלך, ולאחר מכן להוסיף 50 מ"ל של חיץ לשטוף.
7. ספין למטה: הפעל את הצנטריפוגות. כאשר זה מגיע 1300 סל"ד, לכבות אותו.
8. Resuspend גלולה ולשטוף עם 5 מ"ל של חיץ כביסה.
9. העברת מ"ל 5-15 מ"ל חרוטי ספין למטה, כאמור לעיל.
10. לשאוב supernatant כפי לחלוטין ככל האפשר. (חיץ נותרת עלול לגרום שינוי צפיפות של Ficoll).

Ficoll

בצע במהירות. חשיפה ארוכת טווח Ficoll רעיל איים.

1. ודא גלולה שבור לגמרי לפני הוספת ficoll (רקמה רצוף קשה resuspend ב ficoll).
2. Resuspend את הכדור בתוך 7 מ"ל של ficoll, צפיפות 1.108, על ידי vortexing במרץ.
3. שכבה על גבי צפיפות כל ficoll 2ml של כל אחד צפיפויות הנותרים לפי הסדר הבא: 1.096, 1.069, 1.037 אז.
4. ספין במשך 15 דקות ב 1800 סל"ד ב 4 מעלות, עם לנתק!
5. פיק איים מן השכבה השנייה בעזרת spoid (p סטריליתהטפטפת lastic). העברת כל האוספים ל 50 מ"ל המכיל 25 מ"ל חרוטי ~ של חיץ קר.
6. שטפי, כאמור לעיל, 3 פעמים עם חיץ כביסה (חוזרת צעד 12-15).
7. איי Resuspend ב 20 מ"ל RPMI-1640 (FCS המכיל 10% ו פניצילין וסטרפטומיצין, HEPES, מ-NEAA) ומערבבים בעדינות. הסר ul 100 המדגם עבור לספור.
8. העברת 100 ul עד 35 צלחת רשת מ"מ המכילה 1 מ"ל של מדיה 1 dithizone מ"ל.
9. דגירה איים שנותרו RPMI 1640, ב 37 ° C, 7% CO ₂ באינקובטור, ב 160 מ"מ צלחות עם סך של 30 מ"ל של מדיה / צלחת.