שיטה יעילה להשגת מטוהרים שברים meiotic קיימא מהעכבר testis מתואר, המשלבת תא מעודן דיסוציאציה פרוטוקול עם מיון פלורסנט התא הפעיל (FACS). שיטה זו מנצלת את ההבדלים בתוכן דנ"א צפיפות גרעינית של שברים meiotic בדידים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
אופי הטרוגני של סוגי תאים ב testis ואת היעדרם של מודלים תרבות meiotic תא היו מכשולים משמעותיים כדי ללמוד את התוכניות התמיינות ייחודית כי הם לידי ביטוי במהלך המיוזה. שתי השיטות העיקריות פותחו כדי לטהר, בדרגות שונות, שברים meiotic שונים למבוגרים והן בבעלי חיים מפותחים: elutriation או Staput (שקיעה) באמצעות BSA ו / או percoll הדרגתיים. שתי שיטות אלה מסתמכים על גודל התא וצפיפות להפריד תאים meiotic 1-5. בסך הכל, למעט אוכלוסיות תאים ספורים 6, פרוטוקולים אלה אינם מצליחים להניב טוהר מספקת של אוכלוסיות רבות תא meiotic הדרושים ניתוחים מולקולריים מפורט. יתר על כן, עם שיטות כאלה בדרך כלל סוג אחד של תאים meiotic יכול להיות מטוהרים בזמן נתון, אשר מוסיפה רמה נוספת של מורכבות לגבי שחזור והומוגניות כאשר משווים דגימות תאים meiotic.
כאן אנו מתארים שיטה מעודן המאפשר אחד כדי לחזות בקלות, לזהות ולטהר תאים meiotic, החל בתאי הנבט כדי spermatids עגול, באמצעות FACS בשילוב עם מכתים 33342 Hoechst 7,8. שיטה זו מספקת תמונה כוללת של תהליך meiotic כולו מאפשר מאוד לטהר את התאים קיימא משלב ביותר של המיוזה. תאים אלה מטוהרים אז יכול להיות ניתח בפירוט את השינויים המולקולריים שמלווים התקדמות דרך המיוזה, שינויים בביטוי הגנים למשל 9,10 ואת הדינמיקה של תפוסה הנוקלאוזום על נקודות חמות של רקומבינציה meiotic 11.
פרוטוקול
פרוטוקול זה ניתן להפריד בין שני שלבים עיקריים: (1) ניתוק ו Hoechst 33342 מכתים של תאים עכבר testis ואחריו, במידת הצורך, (2) FACS מיון של שברים meiotic הרלוונטיים, כולל כל שלבי המיוזה, מתאי נבט אל בסיבוב spermatids. לאחר שנאספו, אוכלוסיות אלה meiotic מועשר יכול לשמש עבור מגוון רחב של ניתוח. פרוטוקול זה מתאר את ניתוק של אחד testis מבוגר; כרכים ניתן להתאים בהתאם לנערים או האשכים נוספים.
1. Testis דיסוציאציה
- מקום אחד testis decapsulated בצינור 15 מ"ל.
- הוסף 3 מ"ל של הפתרון של גיי מאזן מלח (GBSS) המכיל 120 U / ml של collagenase מסוג I.
- הוסף 10 μl של DNAse אני (פתרון 1mg/ml המניות גליצרול 50%) ולנער אותו נמרצות ביד עד שתראה tubules האשכים מתחילים לנתק.
- להתסיס אופקית מקסימלית של 120 סל"ד במשך 15 דקות על 33 ° C.
- למזוג דקות 1 אנכית בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant.
- חזור על שלבים 1.2-1.5.
- הוסף 2.5 מ"ל של GBSS המכיל סוג collagenase אני, 50 μl של פתרון טריפסין 50mg/ml מניות resuspended בתמיסת HCl 1 מ"מ, ו 10 μl של DNAse אני (1mg/ml), וכן להפוך את הצינור מספר פעמים.
- להתסיס אופקית מקסימלית של 120 סל"ד במשך 15 דקות על 33 ° C.
- שימוש pipet פלסטיק חד פעמיות פסטר עם פתח רחב, פיפטה בעדינות מעלה ומטה במשך 3 גושים min.No צריך להיות גלוי בשלב זה.
- הוסף 30 μl של טריפסין, 10 μl של DNAse אני, 40 μl של Hoechst 33342 resuspended ב DMSO (10 מ"ג / מ"ל), וגם להפוך את הצינור מספר פעמים.
- להתסיס אופקית מקסימלית של 120 סל"ד במשך 15 דקות על 33 ° C.
- הוסף 400 μl של עוברי עגלים בסרום (FCS) ומערבבים על ידי היפוך להשבית טריפסין.
- מכתים הסופי מתבצע על ידי הוספת 50 μl של Hoechst 33342 resuspended ב DMSO (10 מ"ג / מ"ל), וכן 10 μl של DNAse אני (1 מ"ג / מ"ל).
- להתסיס אופקית מקסימלית של 120 סל"ד במשך 15 דקות על 33 ° C.
- המדגם testis ניתק לאחר מכן עבר דרך שני GBSS 40 מיקרומטר מראש הרטובות מסננים חד פעמיות על שפופרת 50 מ"ל חרוטי, ולאחר מכן 5 μl של יודיד propidium (PI) פתרון נוסף מדגם מעורבת pipetting בעדינות על ידי מספר פעמים עם פסטר הפנויה פיפטה.
- לדוגמה מועבר מזרק 5 מ"ל פלסטיק באמצעות מחט 18-מד. האחרון הוא הוחלף על ידי מחט 22-מד למסירה המדגם. מזרק מאוחסן על קרח מוגן מפני האור עד מוכן לעיבוד FACS.
2. FACS התקנה טיהור
- מיון בוצעה על סדרן בקטון דיקינסון, תא IIu Aria. התנאים המתוארים ולכן צריך לשמש כנקודת מוצא במיוחד בעת השימוש במכשירים חשמליים שונים. השתמשנו בתנאים שתוארו קודם לכן 7,8.
- מאז IIu Aria אין לייזר UV, התאמנו את פרוטוקול לאיתור מכתים Hoescht באמצעות לייזר סגול 405nm בנוסף השתמשנו לייזר כחול 488nm לגילוי פיזור קדימה בצד. יתר על כן, מסננים כמה שונו על מנת להגביל כמה leakiness לייזר אדום וכתוצאה מכך חדות משופרת העלילה מפוזרים.
- לייזר סגול הוגדר לעבור עם להקת 450/40nm לגילוי Hoescht כחול הפליטה לעבור הלהקה 585/42nm עבור פליטת האדום Hoescht. עובר זמן רב 502nm שימש נפרד כחול פלואורסצנטי אדום.
- זרבובית 100 מיקרומטר היה בשימוש עם תדר טיפה הכונן של 28,000 טיפות / שנייה. שיעור סף המדגם היה כ 4000 אירועים / שנייה. אפשרות בקרת טמפרטורה שימש כדי לשמור על מדגם וצינורות לאיסוף 4 ° C משך כל מיון. בנוסף, תכונת תסיסה מדגם שימש בסל"ד 200 כדי למנוע את הדוגמה sedimenting ברחבי כזה.
- בדרך כלל, 2-3 האשכים עובדו לכל סוג 6 שעות המאפשר את איסוף 0.5-2.0x10 6 תאים לכל אוכלוסיית (ראה סעיף נציג).
- המדגם מיון aliquots של כ 750μl להימכר המזרק. בינתיים, במהלך הפסקות אלה הצינורות אוסף הוחזקו על 4 ° C, מוגן מפני האור, מעורב בעדינות לפני מעין חידוש.
- הדגימות נאספו מיון לתוך צינור איסוף 12x75mm borosilicated זכוכית המכיל 250μl DMEM FCS בתוספת 10%.
3. נציג תוצאות:
פרופיל טיפוסי FACS מוצג באיור 1. כל השלבים העיקריים של המיוזה מזוהים מצוינים במקרא. אם Hoechst 33342 הכתם אינו אופטימלי, פרופיל העולמית יופיעו הרבה יותר קומפקטי פחות מוגדר. בעיה נפוצה לגבי הוספת DNAse לא מספיק, אשר יניעו clumping תאים מהירה. תוספת נוספת DNAse בכל הצעדים נגדו כתב אישום בדרך כלל פותר בעיה זו. הקפאת הawing של המניות DNAse (המאוחסן ב -20 ° C) צריכה להיות מינימלית, כמו זו גורמת לאובדן מהיר של פעילות האנזים.
Spo11 הוא endonuclease meiotic שמנתב פעמיים גדיל הפסקות באתרים של נקודות חמות רקומבינציה meiotic 12. איור 2 מציג פרופיל אופייני של Spo11-null testis שבו גדיל כפול לשבור לא נוצרים, וכתוצאה מכך המיוזה הנפל 12, כמו גם טרום puberous פרופיל של עכבר 13 ימים הישן, אשר חושף הטבע אסינכרוני של הגל הראשון של המיוזה. תקן מנתח cytogenetic באמצעות שילוב של חלבון מורכב synaptonemal 3 (SCP3) ו phosphorylated נוגדנים H2AX היסטון הבמה הסמנים הספציפיים המיוזה יש להשתמש תחילה אישר את הטוהר ואת אופיו של התאים meiotic מיון, כמתואר elswhere 11.
באיור 1. Wild-type FACS פרופילים המיוזה. א) פיזור העלילה נציג מוצג. התאים מגודרת מוצגים. שים לב כמות גדולה של פסולת נוכח testis מבוגר המכילים בעיקר ממברנות ריקים זנבות spermatid. ב) עלילה נציג לצרכן מראה את כמות מוגבלת מאוד של תאים לצרכן חיובי בהווה במדגם. שער טיפוסי מוצג. ג) נציג wild-type Hoechst 33342 פרופיל FACS מוצג. האוכלוסיות השונות תא meiotic שניתן מטוהרים בשיטה זו למחקר נוסף מצוינים: spermatogonia (SP), טרום leptotene (PL), leptotene-zygotene (L / Z), מוקדם Pachytene (EP), הבינוני Pachytene ( MP), בשלהי Pachytene (LP), diplotene (ד '), סביב spermatids (RS).
איור 2. Spo11-null ו wild-type 13 יום פרופילים FACS meiotic. א) פרופיל טיפוסי Spo11-null מוצג עם כישלון meiotic ברור, שם לא בשלב בעבר leptotene / zygotene מוקדם pachytene ניתן לאתרם. ב) פרופיל של עכבר wild-type 13 יום בן זכר מראה את ריכוז גבוה של תאים leptotene / zygotene. זהו הגל הראשון של המיוזה היא סינכרונית למדי, בבהירות דמיינו שימוש במתודולוגיה זו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול המוצג לעיל מאפשר בו זמנית לטהר מעכברים זכר בוגר את כל טווח של תאים בשלב meiotic עם הטוהר גבוהה מאוד, ומאפשר לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של התהליך הבסיסי הזה. תאים מטוהרים יכול לשמש עבור יישומים רבים, החל 9,10 מיצוי RNA, מיפוי הנוקלאוזום 11, גילוי מולקולה רקומביננטי, מנתח חלבון, ועוד רבים. עם זאת, שיטות זיהוי צריך להיות מותאם לכמות התאים meiotic מטוהרים. יתר על כן, עם שחזור הגבוהה של שיטה זו, ניתן מיני בריכה מרובים עצמאית של שבר אותו ביצע בימים שונים כד...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
פרויקט זה מומן בחלקו על ידי כספי ממדינת פלורידה סקריפס ומספרי הפרס R01GM085079 ו R21HD061304 מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית לבין המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם, בהתאמה. זהו כתב היד מספר 20917 של מכון המחקר סקריפס.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Collagenase Type-1 | Worthington Biochemical | CLSS1 | המס עד לריכוז 12,000U/ml ב-GBSS, אחסון ב-4°C |
| Trypsin | Worthington Biochemical | TRL3 | המס ב-1mM HCl עד לריכוז 50mg/ml, אחסון ב-4°C |
| H–chst 33342 | Acros Organics | 230001000 | תמיסה רוויה (10mg/ml ב-DMSO, אחסון ב-4°C |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | המס במים/50% glycerol עד לריכוז 1mg/ml, אחסון ב-20-°C |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| פיפטה להעברה בגודל 6" | Fisher Scientific | 137119D |
מקורות
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Purification, A. R. culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Namekawa, S. H. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).
- Lassalle, B. Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131, 479-487 (2004).
- Bastos, H. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. Genetic analysis of variation in human meiotic recombination. PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).
- Roig, I. Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis. PLoS Genet. 6, (2010).
- Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots. EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).
- Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis. Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
