Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans</em

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לביצוע הגבלה מוצק צלחת מבוססי תזונתיים ג elegans עם חיידקים נהרג.

תקציר

הפחתת צריכת המזון ללא רעב או תת תזונה ידוע להגדיל את תוחלת החיים ואת לעכב את התחלתה של מחלות הקשורות לגיל שונים במגוון רחב של מינים, כולל יונקים. זה גם גורם לירידה במשקל הגוף, פוריות, כמו גם רמות נמוכות של גלוקוז בדם, אינסולין, IGF-1 אצל בעלי חיים אלה. טיפול זה המכונה לעתים קרובות מגבלה תזונתיים (DR) או הגבלה קלורית (CR). Caenorhabditis elegans נמטודות התפתחה אורגניזם מודל חשוב עבור מחקר על הביולוגיה של ההזדקנות. מניפולציות הן סביבתיים וגנטיים שימשו מודל DR ו הראו כדי להאריך את תוחלת החיים ב C. elegans. עם זאת, רבים דיווחו DR מחקרים ב C. elegans נעשו על ידי הפצת חיות בתקשורת נוזלי, בעוד רוב המחקרים הגנטיים בתחום הזדקנות נעשו על אגר מוצק רגיל צלחות פטרי. כאן אנו מציגים פרוטוקול DR באמצעות תקן NGM אגר מוצק מבוססי צלחת עם חיידקים נהרג.

פרוטוקול

1. הקמת עקומת כיול עבור להערכת ריכוזי חיידקים

סעיף זה מתאר שיטה להערכת ריכוז החיידקים עבור כל זן חיידקי מסוים (למשל OP50, HT115) אשר ישמשו כמקור מזון עבור ניסויים הגבלה תזונתיים ב C. elegans. עקומות כיול נפרדת יש להקים לכל זן חיידקים המשמשים.

1. לחסן מושבה אחת של E. coli OP50 חיידקים שנקטפו פס חדש של חיידקים על אגר LB LB במרק 3 מ"ל נוזל.
2. OP50 המקום והתרבות 37 ° C שייקר ולאפשר לחיידקים לגדול בין לילה.
3. הכנת סידורי 2 פי דילולים של ההשעיה חיידקים מתרבות הלילה (2x, 4x, 8x, 16x, 32x).
4. מדוד את ספיגת (צפיפות אופטית) של דילול זה ב 600 ננומטר על ידי ספקטרופוטומטר בשלושה עותקים.
5. יתר על כן לדלל כל השעיה חיידקי 1,000,000 פי (1000 פי דילול פעמיים).
6. מורחים 0.4 מ"ל של חיידקי ההשעיה של דילול באופן שווה על כל צלחת LB 100 מ"מ אגר.
7. המקום צלחות LB עם OP50 ב 37 ° C חממה 18-24 שעות.
8. ספירת מושבות חיידקים גדל על כל צלחת. ספירת המושבה משמשים כדי לחשב CFU (יחידת המושבה להרכיב) לכל מ"ל עבור כל דגימה.
9. הקשר בין מדד OD ₆₀₀ ערכים OP50 ריכוזי חיידקים ניתן הוקמה על ידי התוויית OD ₆₀₀ כפונקציה של ריכוז חיידקי (CFU / mL) ואת ביצוע ניתוח רגרסיה ליניארית (איור 1).

פתרונות:

מרק לוריא (LB), 1 ליטר:
10 גרם	Bacto-tryptone
5 גרם	תמצית שמרים
10 גרם	NaCl

מוסיפים מים כדי deionized 1L.
החיטוי ולאחסן בטמפרטורת החדר.

2. הכנת מוצק צלחת מבוססי (SDR) צלחות תזונתיים הגבלה

סעיף זה מתאר את הכנת צלחות לשימוש מוצק צלחת מבוסס (SDR) ניסויים תזונתיים הגבלה. בדרך כלל, אנו רואים ריכוז חיידקים של 1 x 10 ¹¹ CFU / mL כתנאי כרצונך מודעה האכלה 1 x 10 ⁸ CFU / mL כתנאי DR אופטימלי האכלה עבור שיטה זו. עם זאת, 4-6 ריכוזי חיידקים שונים ייתכן שיהיה צורך ליצור מערכת יחסים שלמה מינון תלויי עבור SDR ותגובות שלה.

1. לחסן מושבה אחת של E. קולי OP50 חיידקים 3 מ"ל מרק נוזלי LB.
2. מניחים את תרבות OP50 ב 37 ° C שייקר ולאפשר לחיידקים לגדול במשך 6-8 שעות.
3. העברת התרבות OP50 כדי בבקבוק חדש המכיל 500 מ"ל מרק LB, והמקום תרבות OP50 בחזרה 37 ° C שייקר לילה.
4. מדוד את OD ₆₀₀ של התרבות OP50 כדי לקבוע את ריכוז החיידקים (ריכוז מחושב באמצעות עקומת כיול שנוצר חלק 1). דילולים מתאים עשוי להיות נחוץ עבור מדידה מדויקת של ספיגת.
5. גלולה OP50 חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 1500 גרם במשך 20 דקות.
6. Resuspend חיידקים בריכוז של 1 x 10 ¹² CFU / mL.
7. הכן 10 מ"ל התרבות חיידקים בשישה ריכוזים שונים: 1 x 10 ^12, 10 ^{11, 10} 10, 10 ^9, 10, ⁸ 10 ⁷ CFU / ml.
8. פיפטה 0.2 מ"ל של התרבות חיידקים למרכז מ"מ 60 הקרושה צלחת NGM. הימנע מנגיעה את פני השטח של צלחת עם פיפטה קצה, כמו ניקס על פני השטח מאפשרים תולעים להתחפר לתוך צלחות אגר.
9. המקום צלחות 37 ° C החממה במשך שעה 1.
10. החל 10μL של 100mg/mL carbenicillin ו 10 μL של kanamycin 50mg/mL על כל צלחת לעצור את הצמיחה של החיידקים.
11. חנות צלחות עם ריכוזים שונים של אנטיביוטיקה, הרג חיידקים על 4 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי (עד חודש). חשוב להכין ולאחסן צלחות מספיק הניסוי המתוכנן כולו לפחות 1-2 ימים קדימה. באמצעות אצווה זהה של הצלחות הניסויים כולו עדיפה.
12. כדי לבדוק את הכדאיות של חיידקים, חיידקים לגרד כמה מתוך צלחות SDR ופרש אותה על צלחת ריקה NGM עם carbenicillin ו kanamycin. מניחים את צלחת 37 ° C בחממה במשך 6-8 שעות ולאחר מכן לבדוק צמיחה של חיידקים (אין צמיחה חיידקים יש לשים לב).

פתרונות

צמיחה נמטודות מדיה (NGM), 1 ליטר:
3 גרם	NaCl
2.5 גרם	Bacto-Peptone
20 גרם	אגר

ove_content "> החיטוי במשך 40 דקות ולתת להתקרר 65 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף:

1 מ"ל	1 מ 4 MgSO
1 מ"ל	1 M CaCl 2
1 מ"ל	5 מ"ג / מ"ל ​​כולסטרול
25 מ"ל	אשלגן פוספט 1M, 6.0 pH

מיד NGM לשפוך נוזל על 60 מ"מ x 15 מ"מ בצלחות פטרי ב 10 מ"ל aliquots

3. הגדרת ניסויים SDR

עבור רוב SDR-הקשורים ללימודים, כגון ניתוח תוחלת החיים ואת פרופיל פוריות, הכנת האוכלוסייה בגיל מסונכרן של תולעים היא חיונית. עבור מחקרים אחרים, פשוט להעביר תולעים מצלחת לצלחת OP50 קבוע SDR כדי ליזום את הגבלת תזונתיים. בסעיף זה, פרוטוקול להקים ניתוח תוחלת החיים של בעלי חיים SDR מתוארת כדוגמה.

1. השתמש בורר תולעת פלטינה להעביר 20-30 מבוגרים reproductively פעיל על מספר הצלחות NGM קבוע עם OP50. בהתאם למספר הביצים הדרוש הניסויים, מבוגרים יותר עשוי להיות נחוץ.
2. השאירו את הצלחות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות כדי לאפשר ההטלה.
3. הסר את המבוגרים מן הצלחת. צלחות יש לבדוק ויזואלית את הביצים.
4. השאירו את הצלחות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס ולאפשר הצאצאים לפתח לשלב Late-L4/day 1 מבוגר. בדרך כלל זה לוקח 3 ימים תולעים N2 סוגי בר ב 20 ° C.
5. העברת מספר מתאים של 1 מבוגרים יום לצלחת SDR כדי ליזום את הגבלת תזונתיים.
6. לניתוח תוחלת החיים, להקים סך של 6-8 צלחות עם 10-20 תולעים לכל צלחת עבור כל תנאי SDR.
7. ציון את הכדאיות של כל תולעת כל 2 ימים עד שכל התולעים מתו. זה קריטי, כי תולעים יועברו צלחות SDR טריים כל 12-48 שעות כדי למנוע קיפוח מוחלט של מזון.

4. נציג תוצאות:

שמוצג באיור 1 היא מזימה של עקומת כיול עבור נציג להערכת ריכוז OP50 ביחס OD _600. המשוואה שנוצר על ידי ניתוח רגרסיה אניה יכול לשמש עבור כל החישובים העתיד של OP50 ריכוזי חיידקים. שמוצג באיור 2 הוא דוגמה assaying את ההשפעה של טיפולים SDR כרונית על תוחלת החיים הממוצעת של זנים שונים של תולעים. הקו הכחול מייצג תגובה נורמלית מינון תלויי של wild-type תולעים SDR. הקו האדום מציין כי ההשפעה של תוחלת החיים SDR מודחק חלקית על ידי drr OE-2, בעוד daf-16 (mu86) אין כל השפעה על הארכת תוחלת החיים SDR-Induced. פירוט השיטה לביצוע ניתוח תוחלת החיים ב C. elegans מתואר בספרות ^1-3 הקודמת.

באיור 1. התוצאה נציג של עקומת כיול עבור להערכת ה OP50 קולי ריכוז. OP50 ריכוז זממו כפונקציה של מדד OD ₆₀₀ ערכים. ברים שגיאה = התרבות חיידקים SD לילה היה מדולל 8x 1.5x, 2x, 4x, 16x, 32x לפני מדידת ספיגת ו בדילול עוד 1,000 x פעמיים לפני המדידה CFU.

איור 2. התוצאה נציג של C. הניסוי elegans תוחלת החיים השוואת N2 סוג חיות בר (כחול) עם שתי מוטציות שונות (ירוק ואדום) בתגובה SDR (איור מתוך צ'ינג et al. ^4). ברים שגיאה = SEM

דיון

הגבלה תזונתיים (DR) ידוע להגדיל את תוחלת החיים ואת לעכב את התחלתה של מחלות הקשורות לגיל שונים במגוון רחב של מינים, כולל יונקים ^5-7. מניפולציות הן סביבתיים וגנטיים שימשו מודל DR ב C. elegans, כולל תולעים culturing במדיום למחצה מוגדרים נוזל ^8,9, דילול של מקור מזון חיידקים במדיום נוזלי ^10-12, ושימוש מוטנטים התנהגות להאכיל בקצב איטי יותר ^13. עם זאת, מחקה הגנטי של DR עשויה לייצר פנוטיפים שאינן קשורות ל DR, ואילו תולעים culturing בתוו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
Carbenicillin	Duchefa Biochemie	C0109.25	מומס במים.
Kanamycin	רוש	10106801001	מומס במים.
Bacto-peptone	בקטון, דיקינסון החברה	DF0118072
Bacto-tryptone	בקטון, דיקינסון החברה	DF0123075
Bacto-תמצית שמרים	בקטון, דיקינסון החברה	DF0127071
אגר	בקטון, דיקינסון החברה	DF00145170
תרבות סטרילי צינור	ארה"ב מדעי	1485-0810
ספקטרופוטומטר	Amersham Biosciences	ג'ין קוואנט הפרו	Amersham הוא כעת חלק GE Healthcare.
הביתור מיקרוסקופ	Zeiss	STEMI 2000
סרכזת	Beckman Coulter	Accuspin FR