תא חי סידן הדמיה בשילוב עם השתקת siRNA מתווכת ג'ין מזהה Ca 2 + ערוצי דליפה בקרום ER ו מנגנוני ויסות שלהם

סיכום

Reticulum endoplasmic ממלא תפקיד מרכזי ב biogenesis חלבון ו הומאוסטזיס הסידן. הקמנו מערכת ניסויית המאפשרת לנו כתובת תפקידו של ערוצי Ca2 + לדלוף לאפיין את מנגנוני ויסות המתרברבים שלהם. מערכת זו כוללת בתיווך siRNA להשתקת הגן ואת תא חי Ca2 + הדמיה.

תקציר

בתאי יונקים, reticulum endoplasmic (ER) משחקת תפקיד מפתח biogenesis חלבון וגם סידן איתות ^1. מתחם heterotrimeric Sec61 בקרום ER מספק נתיב מימית עבור פוליפפטידים החדש מסונתז לתוך לומן של ER. מחקר שנערך לאחרונה ממעבדות שונות הציע מורכבת זו heterotrimeric עלולות להיווצר Ca ^{2 +} חולף ערוצי דליפה ^2-8. תצפית מפתח רעיון זה היה כי שחרורו של פוליפפטידים המתהווה מן הריבוזום ו Sec61 מורכבים על ידי puromycin מוביל לשחרור זמני של Ca ^{2 +} מ המיון. יתר על כן, לא נצפו במבחנה כי luminal ER חלבון BIP עוסקת במניעת חדירות יונים ברמה של Sec61 ^9,10 מורכבים. הקמנו מערכת ניסויית המאפשרת לנו לפנות ישירות את תפקיד מורכב Sec61 כמו פוטנציאל ערוץ Ca ^{+ 2} לדלוף לאפיין את מנגנוני ויסות המשוערת שלה ^11-13. מערכת זו משלבת בתיווך siRNA להשתקת הגן ואת תא חי Ca ^{2 +} הדמיה ^13. תאים מטופלים עם siRNAs כי מכוונים נגד קידוד האזור מתורגמים (UTR), בהתאמה, של הגן SEC61A1 או siRNA בקרה שלילית. בניתוח השלמה, התאים הם שיתוף transfected עם וקטור IRES-GFP המאפשר siRNA עמידים הביטוי של הגן SEC61A1 wildtype. ואז התאים נטענים עם ratiometric Ca ^{2 +-אינדיקטור} FURA-2 לפקח בו זמנית שינויים cytosolic Ca ^{2 +} ריכוז במספר התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מדידה רציפה של cytosolic Ca ^{2 +} מאפשרת גם להעריך את ההשפעה של גורמים שונים, כגון puromycin, מעכבי מולקולה קטנה, ואת thapsigargin על Ca ^{2 +} דליפה. זו מערכת ניסיונית נותן לנו את הזדמנויות ייחודי i) להעריך את התרומה של חלבונים שונים על ממברנת ER פסיבי Ca ^{2 +} בזרימת מ ER של סוגי תאים שונים, ii) לאפיין את חלבונים מנגנונים המגבילים את Ca ^{2 +} בזרימת פסיבי, ו ג) לחקור את ההשפעות של מוטציות מחלה מקושר המרכיבים הרלבנטיים.

פרוטוקול

1. ההכנה של פתרונות מניות

1. הכן סידן ללא חיץ (140 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM MgCl _2, 0.5 mM EGTA, 10 גלוקוז מ"מ 10 mM HEPES-KOH, (pH 7.35)).
2. Solubilize FURA 02:00 ב-DMSO להשיג 1 מניות פתרון מ"מ. מערבבים בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא צהוב בהיר homogenously. הגן על כוס מן האור. לדלל את FURA, 02:00 פתרון המניה שונה לתוך 1 מ"ל של נשר Dulbecco בינוני (DMEM) המכיל 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין לריכוז סופי של 4 מיקרומטר לטעינה של תאים הלה.
3. הכן 12.5 mM puromycin מניות פתרון במים מזוקקים (pH 7.0). חנות aliquots ב -20 ° C. לדלל את puromycin 12.5 mM מניות פתרון במאגר סידן ללא ריכוז סופי של puromycin 500 מיקרומטר.
4. ממיסים thapsigargin ב DMSO לקבל 1 במלאי פתרון מ"מ.
5. Solubilize 1 מ"ג ophiobolin בכלורופורם 20 μl, ולאחר מכן, לערבב עם DMSO 25 μl. צינור microcentrifuge נשאר פתוח עד כלורופורם הוא התאדה. כך ophiobolin הסופי הריכוז הוא 100 מ"מ. חנות aliquots ב -20 ° C. לפני השימוש, לדלל פתרונות מניות למאגר, סידן חופשי ריכוז סופי של 100 מיקרומטר. לפיכך, הריכוז הסופי DMSO הדמיה תא חי אינו עולה על 0.1%.
6. ממיסים trifluoperazine ב DMSO לריכוז של 10 מ"מ aliquots חנות ב -20 ° C. מדולל פתרונות מניות למאגר, סידן חופשי ריכוז סופי של 10 מיקרומטר לפני השימוש. לכן ריכוז DMSO הסופי הדמיה תא חי, כמו עבור ophiobolin, אינו עולה על 0.1%.
7. ממיסים את siRNAs (SEC61A1 siRNA, SEC61A1 UTR-siRNA ו siRNA שליטה) במים RNase חינם להכין 20 המניות פתרון מיקרומטר. מערבבים בעזרת מערבולת ולבחון solubilization לפי העין. חנות 50 aliquots μl ב -20 ° C.

2. Gene השתקה בתאים הלה

על מנת לחקור את התרומה של חלבון מסוים ER Ca ^{2 +} בזרימת, הגן בהתאמה יש השתיק ביעילות עם שני siRNAs שונה (איור 1). בנוסף, את ההשפעה של השתקה יש להתגבר על הביטוי של הגן סוג בהתאמה בטבע. בדרך כלל אנו משתמשים siRNAs כי מכוונים נגד קידוד ללא קידוד (UTR) באזור, בהתאמה, של הגן של עניין. העסקת UTR מכוונת siRNA מספקת דרך נוחה השלמה.

1. Seed 5.2 x 10 ⁵ הלה תאים (ATCC לא. CCL-2) בצלחת תרבות 6 ס"מ עם תלוש 25 מ"מ המכסה (טרום שטופלו 200 μl של פולי-L-ליזין (1 מ"ג / מ"ל) עבור 1 ח) ב שונה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) המכיל 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין ו לדגור על 37 ° C בסביבת humidified עם 5% CO ₂ (נפח סופי 3.9 מ"ל).
2. Transfect התאים עם SEC61A1 siRNA, SEC61A1 UTR-siRNA, או siRNA שליטה שלילי באמצעות HiPerFect מגיב בהתאם להוראות היצרן (הריכוז הסופי של siRNA: 20 ננומטר). בקיצור, להכין siRNAs טרי צינור microcentrifuge נפרד לפני הליך transfection בפועל: הוסף 20 μl transfection מגיב HiPerFect ל μl 4 של siRNA כל (20 מיקרומטר), כי הוא מומס 80 μl של OptiMEM. תערובת זו vortexed בעדינות מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מוסיפים את תערובת siRNA (104 μl) dropwise של 5.2 seeded x 10 ⁵ תאים הלה (3.9 מ"ל).
3. לאחר 24 שעות, שנה את בינונית (3.9 מ"ל) ו transfect התאים בשנית עם תערובת siRNA זהה (104 μl).
4. הערכת ההשתקה על ידי ניתוח כתם המערבי. זה צריך להיות מעל 80%. שטפו תאים בצלחת תרבית תאים של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) וקציר אותם DMEM. ספירת התאים על ידי העסקת מונה אוטומטי הרוזנת Cell. Lyse התאים חיץ תמוגה התא (10 mM NaCl, 10 mM טריס-HCl, pH 8.0, 3 מ"מ MgCl _2, 0.5% NP40) בתוספת קוקטייל פרוטאז-מעכב (3 מיקרוגרם / מ"ל Pepstatin, 3 מיקרוגרם / Leupeptin מ"ל, 3 מיקרוגרם / מ"ל ​​Antipain, 3 מיקרוגרם / Chymastatin מ"ל) ומערבבים עם חיץ SDS-המדגם (60 מ"מ טריס-HCl, pH 6.8, SDS 2%, גליצרול 10%, 5% β-mercaptoethanol, 0.01% bromphenol כחול ) על מנת לקבל ריכוז סופי של 10.000 תאים / μl. דגימות מחממים על 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן, להוסיף קצת גלאס חרוזים מערבולת של 20 דקות ל-DNA שבר. Μl 20 נפרדת של כל דגימה על ידי Laemmli מסוג SDS-PAGE (בדרך כלל 15% polyacrylamid עבור ג'ל המפריד). העברת חלבונים מופרדים על ידי קרום PVDF electroblotting ("כתם רטוב") בשעה mA 400 קבוע למשך 3 שעות או לילה חיץ העברה (100 מ"מ Glycin, 12.5 מ"מ טריס-HCl). לאחר מכן, בלוק עם 5% (w / v) נמוך חלב מיובש שומן PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לחשוף את הכתם על הנוגדן הראשוני כנגד הסופית-C של Sec61α מ ארנב אנטי β-אקטין הנוגדנים מהעכבר. לשטוף את כתם ב-PBS TritonX-100 (0.05%) ו-twice ב PBS 5 דקות, בהתאמה. דמיינו את הנוגדנים ראשוני באמצעות ECL Plex עזים נגד ארנב IgG-Cy5 או ECL עזים אנטי עכבר Plex IgG-Cy3-המצומד ומערכת טייפון-Trio הדמיה בשילוב עם תמונה קוואנט TL תוכנה 7.0. במקרה של הגן SEC61A1, אפקט השתקה מקסימלית נתפסת בדרך כלל 96 שעות לאחר transfection הראשונה. הניסוי נציג מוצג באיור. 2.

3. השלמה של תאים הלה

על מנת להציל את הפנוטיפ של השתקה SEC61A1, cDNA SEC61A1 היה מוכנס לתוך האתר שיבוט מרובים (MCS) של האתר pCDNA3-פנימי ערך ריבוזומלי (IRES)-GFP-וקטור המכיל את ציטומגלווירוס (CMV) האמרגן, MCS, IRES, בתוספת חלבון fluoresecent ירוק (GFP) רצף קידוד.

1. 48 שעות לאחר transfection siRNA הראשון, חילופי בינוני (3.9 מ"ל) בפעם השנייה ולהפוך את התאים עם וקטור או ריק או SEC61A1 ביטוי פלסמיד באמצעות Fugene HD על פי פרוטוקול של היצרן (יחס הסופי של וקטור Fugene HD הוא 4 מיקרוגרם וקטור 16 μl Fugene HD). בקיצור, להכין פלסמידים טרי צינור microcentrifuge נפרד לפני הליך שינוי: הוסף 16 μl מגיב Fugene HD טרנספורמציה ל 4 מיקרוגרם של כל פלסמיד זה מומס 80 μl של OptiMEM. מערבולת זו בעדינות לערבב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מוסיפים את תערובת פלסמיד (0.1 מ"ל) dropwise את seeded 5.2 x 10 ⁵ תאים הלה (3.9 מ"ל).
2. לאחר 48 שעות של ביטוי פלסמיד, מנות תרבות כפוף מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפני הדמיה סידן קציר. אם יש צורך להחליף DMEM ידי PBS עבור אותות הקרינה יותר טוב. הקלטת תמונות פלואורסצנציה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמת CCD מקורר. יעילות טרנספורמציה ניתן לקבוע על ידי חלוקת מספר התאים המציגים GFP הקרינה על ידי תאים נספר במצב brightfield ויש מעל 80%. תוצאה אופיינית היא באיור. 3.

4. תא חי סידן הדמיה

1. לפני המדידה, להעביר את תלוש לכסות מצופה transfected תאים הלה צלחת נפרדת תרבות 3.5 ס"מ. טען את התאים עם 4 מיקרומטר FURA, 02:00 ב 1 מ"ל DMEM 45 דקות במהירות של 25 ° C ב ^11,12 כהה.
2. תקן 25 מ"מ לכסות להחליק בתא מתכת iMIC ולשטוף תאים פעמיים דגירה של חיץ, סידן חינם (בכל פעם 300 μl).
3. התחל באיסוף נתונים על מיקרוסקופ iMIC צבעוני עם V על ידי מרגש לסירוגין 340 nm ו 380 nm ומדידת הקרינה הנפלטת ב 510 ננומטר (מערכת סינון: beamsplitter, 565 nm;, פולט ננומטר 605/70). לדוגמה תמונות המכיל 20-50 תאים / כל מסגרת 3 s. שיא FURA-2 אותות כמו יחסי F340/F380, שם F340 ו F380 מתאימות עוצמת הקרינה, הרקע מופחתים ב 340 ו 380 ננומטר, בהתאמה.
4. לאחר דקות 1, לטפל בתאים עם puromycin (500 מיקרומטר) במאגר, סידן חופשי או עם חיץ זהה. לחילופין, לטיפול בתאים עם מעכבי מולקולה קטנה (כגון trifluoperazine 10 מיקרומטר או 100 מיקרומטר ophibolin) או עם חיץ סידן חינם.
5. אחרי מדידות ratiometric מבוצעות עבור 2 או 10 דקות, להוסיף thapsigargin (1 מיקרומטר) ולהמשיך את המדידות.
6. בסופו של דבר, cytoslic [Ca ^{2 +]} מוערך ממדידות יחס לפי שיטת כיול הוקמה. ² ניתוח נתונים של Excel 2007 ומוצא 6.1.

5. נציג תוצאות:

עד כה, אנו התייחס לשאלה האם ההשתקה של הגן SEC61A1 משפיע סידן (Ca ^{2 +)} דליפה של ER (איור 1). הגן SEC61A1 הושתק על ידי שני siRNAs שונה בתאים הלה למשך 96 שעות. בעוד השתקה צמיחת תאים מושפע כמעט ואת הכדאיות, תחבורה חלבון לחדר מיון של חצי permeabilized תאים כמעט לחלוטין עכבות. יתר על כן, התאים השתיק SEC61A1 הושפעו קשות לגבי זליגת Ca ^{+ 2} מ ER. ההשפעה של השתקת הגן התהפכה על ידי הביטוי של הגן SEC61A1. לפיכך, Sec61 קומפלקסים שנמצאים בקרום ER של התאים בעלי הגרעין טופס Ca ^{2 +} ערוצי דליפה כי ניתן לצפות לשחק תפקיד מכריע Ca ^{2 +} הומאוסטזיס. עם זאת, נוכחות גדולה, נקבוביות המלאות במים עם חדירות יונים לא מבוקרת, כפי שנוצר על ידי Sec61 מתחמי בקרום ER, היה ברצינות להפריע לשחרור מוסדר של Ca ^{2 +} מ לומן ER לתוך cytosol, מנגנון חיוני תאיים איתות. זיהינו מוטיב (רמ"א) calmodulin מחייב הסופית N-cytosolic של Sec61α יונקים כי CAM קשור אבל לא Ca ^{2 +} ללא apocalmodulin עם זיקה nanomolar וספציפיות רצף. ברמה התאית, שני היריבים CAM שונים מגורה Ca ^{(איורים 4 ו -5). זו האחרונה לא נצפתה כאשר Sec61 ערוצי נכחו שהכיל מוטציות מוטיב IQ של Sec61α. לפיכך, Ca 2 +-CAM מעורב הגבלת Ca 2 + דליפה של ER (איור 6).}

באיור 1. תרשים זרימה. ראו טקסט לקבלת פרטים.

איור 2. ניתוח נתונים עבור השתקה יעילות. השתקת הוערך על ידי ניתוח כתם המערבי באמצעות נוגדנים אשר כוונו נגד Sec61α ו β-אקטין (טעינה מלאה). נוגדנים העיקריים היו דמיינו באמצעות ECL נוגדנים Plex משני דימות פלואורסצנטי.

איור 3. ניתוח נתונים על יעילות transfection. תמונות נרשמו על מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמת CCD מקורר. יעילות טרנספורמציה ניתן לקבוע על ידי חלוקת מספר התאים המציגים GFP הקרינה על ידי תאים נספר במצב brightfield.

איור 4. צילומי מסך מתוך הדמיה סידן לחיות התא של תאים הלה בנוכחות מלאה או SEC61A1-siRNA לבין קיומו או אי קיומו של Cam-אנטגוניסט ophiobolin תאים א הלה טופלו siRNA כנגד SEC61A1 (ב) או siRNA בקרה שלילית (א) עבור 96 שעות כפי שצוין. תאים אלה היו עמוסות מחוון סידן FURA, 02:00 ו מודגרות ב Ca ^{2 +} חיץ חופשי המכיל 0.5 mM EGTA, אז חיץ או ophiobolin (Ophio) במאגר נוספה הדגירה התחדשו. לאחר 10 דקות, Ca ^{2 +} שחרורו יזם יישום thapsigargin (TG) בהעדר Ca ^{2 +} חיצוני ו הדגירה נמשכה. צילומי מסך מתוך הדמיה סידן מתמשכת נלקחו במועדים המצוין.

איור 5. ניתוח נתונים עבור לחיות סידן ניסויים תא הדמיה. (א) ניתוח כמותי קינטי של סדרת ניסויים כמתואר באיור. 4A. Cytoslic [Ca ^{2 +]} נאמד ממדידות יחס לפי שיטת כיול הוקמה ^2. ההשפעה של thapsigargin מוצג בתרשים הבר. (BD) תאים שטופלו siRNA שליטה או המצוין SEC61A1-siRNA למשך 48 שעות ולאחר מכן הפך עם וקטור או שליטה (ג), או ביטוי SEC61A1 פלסמיד (ג), או ביטוי מוטנטי SEC61A1 פלסמיד (ד) כפי שצויין. לאחר 48 שעות, הדמיה ניסויים סידן בוצעו כמו תאנים 4 ו - 5 א. ניתוח סטטיסטי של השינויים cytosolic Ca ^{2 +} ריכוז לאחר תוספת של thapsigargin בניסויים כגון שהוצגו מוצגים. ערכי p <0.001 הוגדרו משמעותי על ידי מבחן t מזווג ו מסומנים על ידי שלוש כוכביות (***), ns, לא משמעותי. המספרים של תאים נותחו מסומנים. ערכים ממוצע מקבלים, ברים שגיאה מייצגים סטיות התקן של אמצעי (SEM). נציין כי דוגמאות אלה הותאמו מ נ"צ. 13.

איור 6. נתונים אלו מעידים כי שחרורו של רשתות המתהווה מתסביך Sec61 אכן גורמת לשחרור סידן מן ER ויצירת nanodomain סידן סביב הפה cytosolic של מורכבות Sec61. סידן זה הוא מחויב calmodulin וסידן-calmodulin סוגר את מורכבות Sec61 ".

דיון

בתאי יונקים, reticulum endoplasmic (ER) משחקת תפקיד מפתח biogenesis חלבון וכן איתות סידן. הנה, יש לנו תיאר מערכת ניסויית המאפשרת לנו ישירות לכתובת תפקיד של אחד פוטנציאל ערוץ Ca ^{+ 2} לדלוף לאפיין את מנגנוני ויסות המשוערת שלה ^13. זו מערכת ניסיונית נותן לנו את הזדמנויות ייחודי i) להעריך את התרומה של חלבונים שונים על ממברנת ER פסיבי Ca ^{2 +} בזרימת מ ER של סוגי תאים שונים, ii) לאפיין את חלבונים מנגנונים המגבילים את Ca ^{2 +} בזרימת פסיבי, ו ג) לחקור את ההשפעות של מוטציות מחלה מקושר המרכיבים הרלבנטיים.

נציין כי רק תאים קיימא צריך להיות מנותח כי הכדאיות הכללית צריכה להיות מעל 80%. לכן, הכדאיות תא מוערך שגרתי העסקת גרעיני-ID כחול / ירוק הכדאיות התא מגיב על פי פרוטוקול של היצרן. יתר על כן, ניתוח סטטיסטי של השינויים cytosolic Ca ^{2 +} בריכוז היא חובה. לכן, הניסויים צריך להתבצע במשך ארבע קבוצות שונות של תאים ושני coverslips עם לפחות 20 תאים צריך להיות מנותח עבור כל תנאי בניסוי יחיד. נציין כי הניסויים השונים צריכים להתבצע בעת ובעונה אחת אחרי זריעת על תלושי לכסות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
DMEM + GlutaMAX	Invitrogen	31966
OptiMEM + GlutaMAX	Invitrogen	51985
FBS	Biochrom	S0115
פניצילין / סטרפטומיצין	PAA	P11-010
HiPerFect	Qiagen	301707
Fugene HD	Roche Diagnostics	04709713
גרעיני-ID כחול / ירוק מגיב כדאיות התא	אנזו מדעי החיים	ENZ-53004
FURA, 02:00	Invitrogen	F-1221
Puromycin	סיגמא	P 7255
Thapsigargin	Invitrogen	T-7459
Ophiobolin	אנזו מדעי החיים	ALX-270-109
Trifluoperazine	סיגמא	T 6062
הרוזנת ® מונה תא אוטומטי	Invitrogen
טייפון-Trio הדמיה מערכת	GE Healthcare
TE2000-S מיקרוסקופ עם מצלמה DS-5Mc	ניקון
מיקרוסקופ עם iMIC צבעוני V	עד Photonics