פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell

Summary

אנו מציגים תפוקה גבוהה פרוטוקול אופטימיזציה שלנו nucleofection כדרך יעילה של transfecting העיקרי האדם מונוציטים הנגזרות תאים דנדריטים עם ה-DNA או פלסמיד siRNA או ללא גרימת התבגרות התא. בנוסף, אנו מספקים ראיות השתקת siRNA מוצלח של הגן ממוקד חבל, אני ב-mRNA והן רמות החלבון.

Abstract

תאים דנדריטים (DCS) יכול להיחשב זקיפים של המערכת החיסונית אשר לשחק תפקיד קריטי בייזום שלה בתגובה לזיהום ^1. זיהוי של אנטיגן פתוגניים ידי DCs נאיבית היא באמצעות הכרה קולטנים דפוס (PRRs) אשר מסוגלים לזהות מבנים ישומרו ספציפי המכונה הפתוגן הקשורים דפוסים מולקולריים (PAMPS). גילוי PAMPs ידי DCs מפעילה מפל איתות תאיים והתוצאה ההפעלה שלהם טרנספורמציה כדי DCs בוגרת. תהליך זה מאופיין בדרך כלל יחד עם ציטוקינים מעודדי דלקת אחרים על ידי ייצור של אינטרפרון מסוג 1, upregulation של תא השטח סמנים כגון MHCII ו CD86 והגירה של DC הבוגרת לבלוטות הלימפה לנקז, שבה האינטראקציה עם בתאי T מפעילה את התגובה החיסונית אדפטיבית ^{2, 3.} לפיכך, DCs הקישור מערכות החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות.

היכולת לנתח את רשתות המולקולריים שבבסיס התגובה DC לפתוגנים שונים חיוני להבנה טובה יותר של ויסות של מסלולים אלו איתות גנים המושרה שלהם. זה אמור גם לעזור להקל על פיתוח של DC מבוסס חיסונים נגד מחלות זיהומיות וגידולים. עם זאת, הקו הזה של המחקר כבר הקשתה קשות הקושי העיקרי transfecting DCs ^4.

התמרה וירוס שיטות, כגון מערכת lentiviral, משמשים בדרך כלל, אבל לשאת מגבלות רבות כגון המורכבות ביו מסוכנים סיכון (עם העלויות הכרוכות) ^5,6,7,8. בנוסף, אספקת המוצרים גנטי נגיפי מעלה את immunogenicity של אלה transduced DCs ^9,10,11,12. Electroporation נעשה שימוש עם תוצאות מעורבות ^13,14,15, אבל אנחנו הראשונים לדווח על השימוש בפרוטוקול תפוקה גבוהה transfection ו משמעי להפגין השירות שלה.

בדוח זה אנו מסכמים פרוטוקול מסחרי אופטימיזציה עבור transfection תפוקה גבוהה של DCs ראשוני האדם, עם רעילות לתא מוגבלת והעדר התבגרות DC ^16. יעילות transfection (של ה-GFP הפלסמיד) ואת כדאיות התא היו יותר מ 50% ו -70% בהתאמה. FACS ניתוח הקים את העדר עלייה ביטוי של סמני הבשלה CD86 ו MHCII בתאים transfected, בעוד qRT-PCR הפגינו שום upregulation של IFNβ. שימוש בפרוטוקול זה electroporation, אנו מספקים ראיות transfection מוצלח של DCs עם siRNA ויעיל להפיל של הגן ממוקד תלבושת-I, קולטן מפתח זיהוי נגיפי ^16,17, ב-mRNA והן רמות החלבון.

Protocol

1. תוכנית Amaxa 96 גם מעבורת Nucleofector

1. פתיחת קובץ פרמטר חדש.
2. בחר את מספר בארות תשתמש עבור transfection תקן ידי גרירת הסמן מעל תרשים 96 את הצלחת היטב. שימוש מינימום של 3 בארות לבריכה למדגם כל הניסוי.
3. את קוד התוכנית קלט: ב part1 בחר 'FF' ו part2 לבחור '168 'מ למשוך את הנפתחים
4. מ ', מונוציטים האדם "תיבת פתרון לבחור
5. תחת אפשרות בקרה בחר 'רגיל'. ....

Discussion

Transfection יעיל של נאיביות תאים דנדריטים הראשוני חשוב לניתוח תפוקה גבוהה הנדסה לאחור של מסלולים דלקתיים הסלולר בתא מפתח זה מתווך את המעבר מולדת-אדפטיבית החיסונית. עם זאת, רוב החוקרים מוצאים כי התאים האלה קשה transfect הן ביעילות וללא הליך התבגרות transfection גרימת התא כאשר שימוש בטכניקות transfection סטנדרטי. אנו בדקו האם המגבלות האלה אפשר להתגבר על ידי אופטימיזציה של פרוטוקול גבוהה התפוקה באמצעות סימולטני, מערכת עצמאית 96-היטב מסחרי transfection גרעיני (Lonza).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ציוד / מגיב	חברה	קטלוג #	תגובות
Amaxa Nucleofector 96-היטב מעבורת	Lonza	108S0109	מספר סידורי
Amaxa האדם מונוציטים 96-Kit היטב Nucleofector	Lonza	VHPA-2007	מכיל את מונוציטים האדם 96-פתרון טוב Nucleofector, מוסף 96-היטב Nucleocuvettes וצלחות
חבל, אני siRNA	Dharmacon	L-012511-00
Glo siRNA	Dharmacon	D-001600-01-20
RPMI 1640	Invitrogen	11875	בתוספת FCS 10%, 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 U / ml פניצילין 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין לעשות בינוני DC צמיחה
DMEM	Invitrogen	11965
L-גלוטמין	Invitrogen	25030081
פניצילין / סטרפטומיצין	Invitrogen	15070063
עגל עוברית סרום	HyClone	3,070.03
תאים דנדריטים	ניו יורק דם במרכז		DCs הם מטוהרים מן מעילים באפי באמצעות הליך רגיל