שיטה זרימה cytometric לזיהוי וניתוח מולקולרית של התמיינות בשלב ספציפי אבות Murine erythroid ומבשרי, ישירות במח שאך שנקטפו עכבר העצם, בטחול או בכבד העובר. Assay מסתמך על פני קרום התא הסמנים CD71, Ter119, וגודל התא.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהוי וניתוח של אבות עכבר Erythroid באמצעות CD71/TER119 Flow-cytometric Assay
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
המחקר של erythropoiesis שמטרתו להבין כיצד תאים אדומים נוצרים אבות hematopoietic מוקדם erythroid. באופן ספציפי, קצב היווצרות תא אדום מווסתת על ידי ההורמון אריתרופויאטין (EPO), אשר מופעלת על ידי סינתזה היפוקסיה ברקמה. איום על תוצאות נאות חמצון הרקמות לעלייה מהירה Epo, נהיגה עלייה בשיעור erythropoietic, תהליך המכונה תגובת דחק erythropoietic. הגידול וכתוצאה מכך מספר מחזורי תאים אדומים משפר את אספקת החמצן לרקמות. התגובה היעילה מתח erythropoietic ולכן קריטי להישרדות והתאוששות ממצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים כגון בגובה רב, אנמיה, דימום, כימותרפיה או השתלת תא גזע.
העכבר הוא מודל מפתח לחקר erythropoiesis ואת תגובת הלחץ שלו. Erythropoiesis עכבר סופי (מבוגרים סוג) מתרחש בכבד העובר בין ימים עובריים 12.5 ו - 15.5, הטחול בילוד, ועל הטחול מבוגרים מוח העצם. שיטות קלאסיות של זיהוי אבות erythroid ברקמות לסמוך על יכולתם של תאים אלה כדי להצמיח מושבות תאים אדום כאשר מצופה ב Epo המכילים מוצקים למחצה בתקשורת. הצאצאים שלהם erythroid מבשר מזוהים על פי קריטריונים מורפולוגיים. אף אחת השיטות הקלאסיות לאפשר גישה למספר גדול של בידול בשלב ספציפי בתאי erythroid למחקר המולקולרי. כאן אנו מציגים שיטה זרימה cytometric לזהות וללמוד בידול בשלב ספציפי אבות erythroid ומבשרי, ישירות בהקשר של רקמות העכבר מבודדים טרי. Assay מסתמך על פני קרום התא הסמנים CD71, Ter119, ועל פרמטר זרימת cytometric "קדימה להתפזר", אשר הוא פונקציה של גודל התא. Assay CD71/Ter119 ניתן ללמוד אבות erythroid במהלך התגובה שלהם ללחץ erythropoietic in vivo, למשל, בעכברים או בעכברים אנמי שוכנו בתנאים חמצן נמוכה. זה עשוי לשמש גם כדי ללמוד אבות erythroid ישירות ברקמות של עוברי עכברים בוגרים או מהונדסים גנטית, כדי להעריך את התפקיד הספציפי של מסלול מולקולרי שונה ב erythropoiesis.
פרוטוקול
1. קציר של רקמות
- הכן צינורות המכיל 2-5 מכתים קר מ"ל חוצץ (בופר פוספט (PBS) עם ארגון ה-BSA הוסיף 0.2% ו גלוקוז 5 מ"מ). שמור צינורות על הקרח לפני הקציר רקמות.
- עכברים ללקט על פי פרוטוקול שאושר המתאים (למשל 2 משאיפת CO ואחריו נקע בצוואר הרחם).
- להקיז דם על ידי דקירה לתוך הלב EDTA או הפרין דם אוסף צינורות לצורך ניתוח מאוחר יותר, למשל של המטוקריט, לספור reticulocyte או ניתוח CBC.
- קציר את....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המתודולוגיה זרימה cytometric מאפשר חקירה סימולטני של כל פונקציה תאית עשויה להתגלות עם נוגדן פלואורסצנטי, מצומדות ליגנד ספציפי או, כולל משטח סמנים התא, ביטוי חלבון, הישרדות התא, מאותת לתא באמצעות נוגדנים ספציפיים phospho 3 מחזור מצב התא. מדידות אלה עשויים להיות בכל מספר בידול בשלב תת ספציפי, בהקשר של רקמה erythropoietic מבודדים טרי. שיטה זו ולכן מאפשר הערכה של שינויים פונקציונליים מולקולרית ברמות שונות של מערכת erythropoietic, בתגובה למגוון רחב של גירויים erythropoietic .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת מסצ'וסטס בבית הספר לרפואה IACUC הוועדה.
תודות
אנו מודים הליבה UMass cytometry זרימה: ריצ'רד Konz, טד Giehl, ברברה גוזלן, Yuehua גו ותמי Krupoch. עבודה זו מומנה על ידי NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) ו-NIH CA T32-130807 (JRS). משאבים Core נתמך על ידי לאנדוקרינולוגיה וסוכרת במרכז המחקר מענק DK32520 שימשו גם.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | |
| פאס-ביוטין | BD Pharmingen | 554256 | |
| Streptavidin-APC | מולקולרית בדיקות | S868 | |
| 40 מיקרומטר תא סטרילי מסננת | Fisherbrand | 22363547 | |
| פוליסטירן מסביב לתחתית צינורות עבור מכתים FACS | BD פלקון | 352008 | |
| U-96 גם צלחת תחתית | BD פלקון | 353910 | |
| ChromePure הארנב IgG | ג'קסון ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| CD71-FITC (מניות 0.5mg/ml) | BD-Biosciences | 553266 | |
| Ter119-PE (מניות 0.2mg/ml) | BD-Biosciences | 553673 | |
| 7AAD | BD-Biosciences | 559925 | |
| DAPI אבקת | רוש | 236276 | |
| FITC עכברוש Anti-CD41 עכבר MWReg30 | BD Pharmingen | 553848 | |
| FITC עכברוש אנטי עכבר CD45R/B220 RA3-6B2 | BD Pharmingen | 553087 | |
| FITC עכברוש אנטי עכבר CD411b/Mac-1 M1/70 | BD Pharmingen | 557396 | |
| FITC אנטי עכבר עכברוש Ly-6g ו Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 | BD Pharmingen | 553126 | |
| FITC אוגר אנטי עכבר CD3e 145-2C11 | BD Pharmingen | 553061 | |
| APC BrdU תזרים ערכת | BD Pharmingen | 557892 | |
| Annexin V-ביוטין | BD Pharmingen | 556418 |
מקורות
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
