הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

12.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/2813

⸱

16 ביולי 2011

 ,  , 
1The Sprott Center for Stem Cell Research, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

במאמר זה

סיכום

לשעבר vivo פרוטוקול לייצר תאים אנושיים בוגרים הדם האדומים מתוך גזע / אבות hematopoietic מתואר. בנוסף אנו מתארים שיטה יעילה משלוח lentiviral ל מציאה גורם שעתוק בתוך TAL1 העיקרי תאים erythroid. היעילות של משלוח גן בתיווך lentivirus מודגמת באמצעות וירוסים GFP להביע.

תקציר

Erythropoiesis היא מערכת מודל נפוץ ללמוד התמיינות תאים. במהלך erythropoiesis, pluripotent אדם מבוגר hematopoietic בתאי גזע (HSCs) להתמיין אבות oligopotent, מבשרי מחויב ובוגרת כדוריות דם אדומות 1. תהליך זה מווסת על חלק גדול ברמה של ביטוי גנים, לפיו גורמי שעתוק ספציפיים להפעיל השושלת גנים ספציפיים במקביל תוך הדחקת גנים ספציפיים סוגי תאים אחרים 2. מחקרים על גורמי תעתוק ויסות erythropoiesis מבוצעות בדרך כלל באמצעות שורות תאים אנושיים המייצגות Murine, במידה מסוימת, תאים erythroid בשלבים נתון של בידול 3-5. שורות תאים יכולים להפוך זאת באופן חלקי בלבד לחקות תאים erythroid והכי חשוב הם לא מאפשרים אחד comprehensibly המחקר שינויים דינמיים המתרחשים התקדמות תאים בשלבים רבים לקראת גורלו הסופי erythroid שלהם. לכן, האתגר הנוכחי נותר פיתוח פרוטוקול להשיג אוכלוסיות הומוגניות יחסית של HSCs הראשי erythroid תאים בשלבים שונים של התמיינות בכמויות מספיקות כדי לבצע גנומיקה ניסויים proteomics.

כאן אנו מתארים vivo לשעבר לתא תרבות פרוטוקול להשרות התמיינות erythroid מן האדם גזע / ובתאים hematopoietic שהיו מבודדים מהדם או טבורי, מח עצם או דם היקפי מבוגר מגויסת עם G-CSF (leukapheresis). מערכת זו תרבות, שפותחה לראשונה על ידי המעבדה Douay 6, משתמשת ציטוקינים ושיתוף תרבות על תאים mesenchymal לחקות את microenvironment מח עצם. שימוש בפרוטוקול לשעבר בידול vivo, אנו צופים הגברה חזקה של אבות erythroid, אינדוקציה של דיפרנציאציה אך ורק כלפי השושלת erythroid ו התבגרות להשלים לשלב enucleated כדוריות דם אדומות. לכן, מערכת זו מספקת הזדמנות ללמוד את המנגנון המולקולרי של ויסות תעתיק התקדמות בתאי גזע hematopoietic לאורך השושלת erythroid.

לימוד erythropoiesis ברמה תעתיק גם דורש את היכולת גורמים ספציפיים מעל מפורשת או מציאה ב העיקרי תאים erythroid. לשם כך, אנו משתמשים lentivirus בתיווך משלוח גן מערכת המאפשרת זיהום יעיל של שניהם חלוקת ולא חלוקת תאים 7. כאן אנו מראים כי אנו מסוגלים ביעילות מציאה גורם שעתוק בתוך TAL1 העיקרי erythroid תאים אנושיים. בנוסף, ביטוי של GFP מדגים יעילות של זיהום lentiviral קרוב ל 90%. לפיכך, פרוטוקול שלנו מספק מערכת שימושית מאוד עבור אפיון של רשת רגולטורית של גורמי תעתוק כי erythropoiesis שליטה.

פרוטוקול

חלק I. erythropoiesis ex vivo של תאי גזע/פרוגניטורים המטופואטיים אנושיים

1. בידוד תאי גזע/প্রו-גנטורים המטופויטים אנושיים מסוג CD34+

אוכלוסיית תאי CD34+ אנושיים, הכוללת תערובת של תאי גזע המטופואטיים (HSCs) ופרוגניטורים מוקדמים 8, נאספת מדם שורי, מדם פריפרי שגויס באמצעות G-CSF (לוקפירהזה) או ממח עצם (איור 1-שלב 1). במקרה של שימוש בדם שורי או בדם פריפרי, יש לעבור ישירות לשלב 1.2. במקרה של שימוש במח עצם, יש להתחיל בשלב 1.1. לריאגנטים ולציוד, ראו טבלה 1.

שלב זה מבוצע בתנאים סטריליים (כלומר, במנדף) ובטמפרטורת החדר (RT), אלא אם צוין אחרת.

  1. הכנת תרחיף תאים בודדים ממוח עצם:
    1. יש להשעות את מוח העצם ב-10 נפחים של RPMI 1640 המכיל 0.02% collagenase B ו-100 U/ml DNase 1
    2. ערבב בעדינות על שייקר מאזניים למשך 45 min.
    3. סנן את התאים דרך רשת ניילון של 30μm.
  2. בידוד תאים מונונוקליאריים (MNCs) בעלי צפיפות נמוכה באמצעות סרטיבציה במדרג צפיפות Ficoll:
    1. דלל את תרחיף הדם או מוח העצם עם 2-4 נפחים של PBS המכיל 2% fetal bovine serum (FBS) ו-2mM EDTA. הערה: נפחים גבוהים יותר מגבירים את טהוּר התאים המונונוקליאריים.
    2. במבחנה קונית של 50 ml, שכב בזהירות 35 ml של תרחיף התאים המדולל מעל 15 ml של Ficoll-paque. סרטיב ב-400g למשך 30 min. ברוטור מסוג swinging-bucket ללא בלם.
    3. שאב את השכבה העליונה תוך השארת שכבת ה-MNC הבינונית ללא הפרעה.
    4. העבר את שכבת הממשק (המכילה MNCs) למבחנה קונית חדשה של 50 ml.
    5. הוסף PBS המכיל 2% FBS ו-2 mM EDTA כדי למלא את המבחנה, ערבב בעדינות על ידי הפיכת המבחנה וסרטיב ב-300g למשך 10 min. ב-RT. השלך את העלייה.
    6. שטוף את משקע התאים פעמיים נוספות כדי להסיר טסיות דם. הערה: שלב זה מגביר את טהוּר התאים מסוג CD34+.
    7. קח 20 μl מתרחיף התאים והעבר למבחנת אפנדורף. הוסף 200 μl של Red Blood Cells Lysis Buffer (טבלה 1) והדגר ב-RT למשך 2 min. הנח 18 μl מתרחיף זה תחת המוצימטומטר וספור את התאים המונונוקליאריים בעלי הגרעין.
    8. ניתן להשתמש ב-MNCs באופן מיידי או להקפיאם בריכוז של 108 תאים/ml בתווך גידול תאים המכיל 10% DMSO ולאחסנם בחנקן נוזלי.
  3. בידוד תאים מסוג CD34+ באמצעות סלקציה אימונו-מגנטית חיובית (איור 1-שלב 1)
    אנו משתמשים בערכת CD34 Microbead Kit (המכילה תמיסה של Microbeads המשורשרים לנוגדנים מונוקלונליים של עכבר נגד CD34 אנושי ותמיסה של FcR Blocking Reagent המכילה IgG אנושי) בשילוב עם שתי עמודות LS Mini-Macs, autoMACS Running Buffer ומפריד MiniMACS Separator (טבלה 1). להלן נתאר את הפרוטוקול שלנו החל מ-2.3x108 MNCs. במידה ונעשה שימוש במספרים שונים של תאים, יש להתאים את הנפחים בהתאם. בנוסף, עבור עד 2x108 MNCs ניתן להשתמש בעמודת MS MiniMacs במקום בעמודת LS MiniMacs.
    שמור על התאים והריאגנטים קרים (4-8°C) כדי למנוע הצטברות (capping) של נוגדים על פני השטח של התא וסימון תאים לא ספציפי.
    1. השעה את המשקע המכיל 2.3x108 MNCs ב-690 μl של Running Buffer (300 μl לכל 108 MNCs, כאשר 300 μl הוא נפח ההשעיה המינימלי הנדרש) והעבר למבחנה קונית של 15 ml.
    2. הוסף 230 μl של FcR Blocking Reagent
    3. הוסף 230 μl של תמיסת CD34 MicroBeads.
    4. ערבב היטב ידנית והדגר למשך 30 min. ב-4°C.
    5. שטוף את התאים על ידי הוספת 10 ml Running Buffer וסרטיב ב-300g למשך 10 min.
    6. שאב את העלייה לחלוטין.
    7. השעה את התאים ב-1.2 ml Running Buffer (השתמש ב-0.5 ml תמיסה לכל 108 MNCs) הערה: חשוב להשיג תרחיף של תאים בודדים לפני ההפרדה המגנטית. במידת הצורך, העבר את התאים דרך רשת ניילון של 30μm להסרת גושי תאים.
    8. הכן את עמודת ה-LS על ידי הנחתה בשדה המגנטי של MiniMACS Separator.
    9. שטוף את העמודה עם 3 ml Running Buffer.
    10. העלה 1.2 ml של תרחיף תאים על העמודה.
    11. אסוף את השאריות שעברו (flow-through) והשתמש בהן כדי לאמת את התנובה והטהוּר של בידוד תאי ה-CD34+. לחלופין, הקפא את התאים הכלולים בפרקציה זו ואחסנם בחנקן נוזלי. הערה: פרקציה זו מכילה תאים לא מסומנים ועשויה להכיל גם תאי CD34+ מסומנים שלא נצמדו לעמודה.
    12. שטוף את העמודה שלוש פעמים עם 3 ml של Running Buffer, איחד את השטיפות, והשתמש בפרקציה זו באופן דומה לפרקציית ה-flow-through לעיל.
    13. הסר את העמודה מהמגנט והנח אותה על מבחנת איסוף מפוליפרופילן של 15 ml.
    14. כדי לאלוציית התאים, הוסף 5 ml של Running Buffer על העמודה ושטוף מיד את תאי ה-CD34+ המסומנים על ידי לחיצה חזקה של הבוכנה לתוך העמודה.
    15. חזור על הליך טהרת העמודה (שלבים h עד n) על ידי העברת התאים דרך עמודת LS שהוכנה acabado. הערה: פעולה זו מגבירה את טהוּר תאי ה-CD34+. מתרחיף של 2.3x108 MNCs שבודדו מלוקאפרזיס, אנו מקבלים בדרך כלל 1.1x106 תאי CD34+ בטהוּר של > 95±3% (איור 1-שלב 1).
    16. הקפא את התאים בתווך גידול המכיל 10% DMSO ואחסן בחנקן נוזלי או המשך ישירות לשלב 2).

2. דיפרנציאציה אריתרואידית בתרבית תאים

תאי CD34+ גודלים במצע IMDM מועשר עם אספקה רצופה של הידרוקורטיזון ושילובים ספציפיים של ציטוקינים לפי פרוטוקול בן ארבעה שלבים המותאם מ-6 (איור 1-שלב 2). סדרת בדיקות מבוצעת לאורך התהליך כדי לאמת את צמיחת התאים ואת הדיפרנציאציה האריתרואידית.

מספר תאי ה-CD34+ הדרושים לתחילת תרבית הוא משתנה, ותלוי בהיקף הניסוי. בדרך כלל, עבור מחקרי ביטוי גנים אנו מבצעים תרבית בהיקף קטן המתחילה עם 0.1x106 תאי CD34+ ב-10 ml מצע, ושומרים על נפחים קטנים על ידי הקפאת תאים עודפים לאורך הפרוצדורה. במחקרים הדורשים מיצוי חלבונים, התרביות מבוצעות בהיקף גדול יותר. כאן אנו מתארים ניסוי בהיקף גדול שבו אנו מתחילים עם ~7x106 תאי CD34+ שהבודדו מלוֹקפֶרֶזִיס (leukapheresis).
תנאי סטריליות נשמרים לאורך כל התהליך. ראו טבלאות 1, 2 ו-3 עבור הריאגנטים.

  1. הכנת ריאגנטים
    1. הכינו את מצע ה-IMDM המושלם כפי שמתואר בטבלה 2 והקפיאו מנות (aliquots) של 40 ml בטמפרטורה של -20°C (ניתן לבצע זאת מראש).
    2. הכינו תמיסות סטוק של הידרוקורטיזון וציטוקינים כפי שמתואר בטבלה 3.
  2. שלב 1: ימים 0-11
    תאי המטופויים גודלים במצע IMDM מושלם המכיל הידרוקורטיזון (HC), גורם לשמירה על תאי גזע (SCF), אינטרלוקין 3 (IL-3) ואריתרופואטין (EPO) (טבלה 3). תאי סטרומה של מחית עצם עכברית מסוג MS-5 (טבלה 1) מרובים כהכנה לשלב 2.
    • יום 0:
      1. חממו מראש 120 ml של מצע IMDM מושלם והוסיפו HC, SCF, IL-3 ו-EPO (טבלה 3).
      2. הפשיתו 7x106 תאי CD34+ על ידי הנחת המבחנה/ות תחילה באמבט מים של 37°C. בעוד התאים עדיין קפואים, הוסיפו 1 ml של מצע שחומם מראש והעבירו את התאים למבחנה קונית של 15 ml. שטפו את המבחנה עם 2 ml מצע והעבירו למבחנה של 15 ml.
      3. הוסיפו 6 ml מצע לתסמיך התאים, ערבבו על ידי היפוך המבחנה וסובבו ב-200 g למשך 5 דקות.
      4. שאבו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את משקע התאים (cell pellet) ב-10 ml מצע טרי.
      5. ספרו תאים חיים באמצעות המוציטומטר לאחר ערבוב של 10 μl מתסמיך התאים עם 10 μl תמיסת Trypan Blue (טבלה 1). הערה: שיעור מוות של תאים הוא כ-25% במהלך ההפשרה, לכן ריכוז התאים החיים צריך להיות ~0.5x106 תא/מ"ל.
      6. שמרו כ-3 ml מתסמיך התאים לבדיקות (ראו פסקה 6).
      7. העבירו את 7 ml הנותרים לבקבוק T-175 והוסיפו 63 ml מצע כדי להגיע לריכוז של 0.05x106 תא/מ"ל ב-70 ml, והניחו את הבקבוק באינקובטור ב-37°C.
    • יום 1:
      1. חממו מראש 85 ml של מצע לתרבית תאי MS-5: αMEM עם Glutamax (טבלה 1), 10% FBS ו-100 U/ml פניצילין ו-100 μg/ml סטפטומייצין.
      2. הכינו שלוש צלחוני תרבית עגולים של 150mm x 25mm, כשבכל אחד נזרעו 2x106 תאי MS-5 ב-25 ml מצע כדי להגיע לריכוז של 0.08x106 תא/מ"ל, והניחו באינקובטור של 37°C. הערה: תוצאות מיטביות מתקבלות בשימוש בתאי MS-5 במעברים נמוכים (<20). יש להרחיב תרבית עםצפיפות גבוהה (confluent) על ידי פיצול 1:5 כל שלושה ימים באמצעות טריפסין המכיל 0.05% EDTA.
    • יום 2:
      1. ספרו תאים המטופויים עם Trypan blue כדי להחריג תאים מתים, ואספו את התאים הדרושים (כלומר כ-20 ml מהתרבית) לבדיקות (ראו פסקה 6). הערה: בניסיון שלנו, במהלך השניים ימים הראשונים, שיעור מוות של תאים עשוי לעלות על 30-50%, ולכן ריכוז התאים הסופי הוא בדרך כלל קרוב לזה של יום 0 (איור 2).
      2. החליפו את מצע תרבית ה-MS-5 ב-25 ml מצע טרי, תוך הבטחה שתאי MS-5 שלא נצמדו יוסרו.
    • יום 4:
      1. ספרו תאים המטופויים עם Trypan blue כדי להחריג תאים מתים, ואספו את התאים הדרושים (כלומר כ-10 ml מהתרבית) לבדיקות (ראו פסקה 6). הערה: בשלב זה, התאים אמורים להתחיל להתרבות עם >75% תאים חיים בריכוז של ~0.2x106 תא/מ"ל. ניתן להקפיא תאים בריכוז של 1-2x106 תא/מ"ל במצע IMDM מושלם המכיל 10% DMSO ולאחסנם בחנקן נוזלי.
      2. העבירו את כ-40 ml הנותרים של התרבית לבקבוק T-175 והוסיפו מספיק מצע IMDM מושלם המכיל HC, SCF, IL-3 ו-EPO (טבלה 3) כדי להגיע לנפח סופי של 150 ml. הערה: ריכוז התאים צריך להיות ~0.05x106 תא/מ"ל.
      3. הרחיבו את תאי ה-MS-5 (שצריכים להיות ב-60-70% צפיפות) על ידי דילולם 1:5 לצלחוני תרבית עגולים חדשים של 150mm x 25 mm באמצעות טריפסין 0.05% EDTA. ריכוז התאים הסופי צריך להיות ~0.08x106 תא/מ"ל. הערה: בדרך כלל, ניתן להרחיב צלחון אחד 5 פעמים, כך שיהיו לכם 15 צלחונים של תאי MS-5 בריכוז של ~0.08x106 תא/מ"ל.
    • יום 6:
      1. ספרו תאים המטופויים עם Trypan blue כדי להחריג תאים מתים, ואספו את מספר התאים הדרוש (כלומר כ-5 ml מהתרבית) לבדיקות (ראו פסקה 6). הערה: התאים נמצאים בשלב של שגשוג גבוה ויש לשמור על ריכוז תאים של ≤1.5x106 תא/מ"ל. אם ריכוז התאים גבוה יותר, הוסיפו מצע IMDM מושלם טרי המכיל HC, SCF, IL-3 ו-EPO.
    • יום 7:
      1. ספרו תאים המטופויים עם Trypan blue כדי להחריג תאים מתים. הערה: בניסיון שלנו, תאים מגיעים בדרך כלל לצפיפות של 1.5x106 תא/מ"ל ביום 7.
      2. הוסיפו מספיק מצע כדי לשמור על ריכוז תאים של ~0.8x106 תא/מ"ל. הערה: אנו מוסיפים בדרך כלל 100 ml מצע IMDM מושלם טרי המכיל HC, SCF, IL-3 ו-EPO כדי להגיע ל-245 ml של תאים בריכוז של ~0.8x106 תא/מ"ל.
      3. הרחיבו את תאי ה-MS-5 (שצריכים להיות ב-60-70% צפיפות) על ידי דילולם 1:5 לבקבוקי T-175 (במקום צלחונים) באמצעות טריפסין 0.05% EDTA. ריכוז התאים הסופי צריך להיות ~0.08x106 תא/מ"ל. הערה: יש להכין 61 בקבוקים של תאי MS-5 בריכוז של ~0.08x106 תא/מ"ל. הקפיאו את תאי ה-MS-5 הנותרים ואחסנו אותם בחנקן נוזלי.
    • יום 8:
      1. ספרו תאים המטופויים עם Trypan blue כדי להחריג תאים מתים, ואספו את מספר התאים הדרוש (כלומר כ-5 ml מהתרבית) לבדיקות (ראו פסקה 6). הערה: צפיפות התאים צריכה להיות ~1x106 תא/מ"ל.
      2. חממו מראש 2L של מצע IMDM מושלם המכיל SCF ו-EPO בלבד (טבלאות 2 ו-3).
      3. אספו 200 ml של תרבית המטופויים (המכילה ~200x106 תאים), סובבו ב-200 g למשך 10 דקות, שאבו את הנוזל העליון ותלו את משקע התאים ב-40 ml מצע IMDM מושלם המכיל SCF ו-EPO.
      4. חלקו את תסמיך התאים ל-8 בקבוקי T-175 (5 ml לבקבוק) והוסיפו 245 ml מצע IMDM מושלם המכיל SCF ו-EPO לכל בקבוק. הערה: כעת יש לנו 8 בקבוקים, כשבכל אחד 250 ml תאים בריכוז של 0.1x106 תא/מ"ל.
      5. ניתן להקפיא את התאים הנותרים (~40ml) ביום 8 בריכוז של 1-2x106 תא/מ"ל במצע IMDM מושלם המכיל 10% DMSO ולאחסנם בחנקן נוזלי.
    • יום 10:
      1. ספרו תאים המטופויים עם Trypan blue כדי להחריג תאים מתים, ואספו את מספר התאים הדרוש (כלומר כ-5 ml מהתרבית) לבדיקות (ראו פסקה 6). הערה: צפיפות התאים צריכה להיות ~1x106 תא/מ"ל.
  3. שלב 2: ימים 11-15
    כמחצית מהתאים נאספים לשימוש עתידי (למשל, מיצוי גרעיני). התאים האריתרואידים הנותרים גדלים בתרבית משותפת (co-culture) על תאי MS-5 במצע IMDM מושלם המכיל EPO (טבלאות 2 ו-3). יש להעביר תאים אריתרואידים לשכבת MS-5 טריה כל 3-4 ימים.
    • יום 11:
      1. ספרו תאים אריתרואידים עם Trypan blue כדי להחריג תאים מתים. הערה: צפיפות התאים צריכה להיות ~1.5x106 תא/מ"ל.
      2. חממו מראש ב-37°C את 1L של 1xPBS, 400ml של מצע IMDM מושלם ו-5L של מצע IMDM מושלם המכיל EPO (טבלאות 2 ו-3).
      3. השאירו נפח תרבית השווה ל-15x108 תאים (למשל כ-4 בקבוקים של 250 ml כל אחד) ועברו לסעיף ה'.
      4. את התאים הנותרים (למשל 15x108) אספו למבחנות קוניות, סובבו ב-450 g למשך 10 דקות, תלו בבפר MS30 קר (טבלה 5) המכיל 0.1mM DTT בריכוז מקסימלי של 108 תא/מ"ל, ואחסנו ב-80°C- לאחר הקפאה מהירה (snap-freeze) בחנקן נוזלי לשימוש עתידי (למשל, מיצוי גרעיני).
      5. שטפו 50 בקבוקים של תאי MS-5 בצפיפות גבוהה עם 20 ml של 1xPBS לכל אחד, והוסיפו מיד 80 ml מצע IMDM מושלם טרי המכיל EPO לכל בקבוק. הערה: בשל מספר הבקבוקים הגדול, אנו מעבדים 4 בקבוקים בכל פעם. באופן מדויק: אנו מוציאים 4 בקבוקים של תאי MS-5 בצפיפות גבוהה מהאינקובטור, שוטפים אותם ב-1xPBS, מוסיפים 80 ml מצע ומחזירים את הבקבוקים לאינקובטור. כאשר כל הבקבוקים מוכנים ומוחזרים לאינקובטור, אנו ממשיכים לשלב ו'. בשל מספר הבקבוקים שיש לעבד בהליך רחב-היקף, מומלץ ששלבים אלו יבוצעו על ידי שני אנשים העובדים בו-זמנית.
      6. סובבו את הכמות השקולה ל-15x108 תאים אריתרואידים ב-4 מבחנות קוניות ב-450 g למשך 10 דקות והשליכו את הנוזל העליון.
      7. שטפו את 4 משקעי התאים ב-100 ml של מצע IMDM מושלם לכל אחד.
      8. תלו כל משקע תאים ב-250 ml מצע IMDM מושלם המכיל EPO וחלקו 20 ml מתסמיך תאים זה לכל אחד מ-50 הבקבוקים המכילים תאי MS-5 ו-80ml מצע. הערה: בשלב זה, צריכים להיות לכם 50 בקבוקים עם תאי MS-5 בצפיפות גבוהה המכילים 100 ml תאים אריתרואידים בריכוז של 0.3x106 תא/מ"ל.
      9. הרחיבו את 11 הבקבוקים הנותרים של תאי MS-5 על ידי דילולם 1:5 לבקבוקי T-175 באמצעות טריפסין 0.05% EDTA. ריכוז התאים הסופי צריך להיות ~0.08x106 תא/מ"ל. הערה: יש להכין 55 בקבוקים של תאי MS-5 בריכוז של ~0.08x106 תא/מ"ל.
    • יום 12:
      1. ספרו תאים אריתרואידים עם Trypan blue כדי להחריג תאים מתים, ואספו את מספר התאים הדרוש (כלומר כ-4 ml מהתרבית) לבדיקות (ראו פסקה 6). הערה: צפיפות התאים צריכה להיות ~0.6x106 תא/מ"ל.
    • יום 14:
      1. ספרו תאים אריתרואידים עם Trypan blue כדי להחריג תאים מתים, ואספו את מספר התאים הדרוש (כלומר כ-3 ml מהתרבית) לבדיקות (ראו פסקה 6). הערה: צפיפות התאים צריכה להיות ~0.9x106 תא/מ"ל.
  4. שלב 3: ימים 15-18
    חלק מהתאים נאספים לשימוש עתידי (למשל, מיצוי גרעיני). התאים האריתרואידים הנותרים גדלים בתרבית משותפת על תאי MS-5 במצע IMDM מושלם ללא ציטוקינים.
    • יום 15:
      1. ספרו תאים אריתרואידים עם Trypan blue כדי להחריג תאים מתים. הערה: צפיפות התאים צריכה להיות ~1x106 תא/מ"ל.
      2. חממו מראש ב-37°C את 1L של 1xPBS ו-5L של מצע IMDM מושלם (טבלה 2).
      3. השאירו נפח תרבית השווה ל-10x108 תאים (למשל כ-10 בקבוקים של 100 ml כל אחד) ועברו לסעיף ה'.
      4. את התאים הנותרים (למשל 40x108) אספו ותלו בבפר MS30 קר (טבלה 5) המכיל 0.1mM DTT לשימוש עתידי (ראו שלב 2: יום 11 סעיף ד').
      5. שטפו 50 בקבוקים של תאי MS-5 בצפיפות גבוהה עם 20 ml של 1xPBS לכל אחד, והוסיפו מיד 80 ml מצע IMDM מושלם טרי לכל בקבוק.
      6. סובבו את הכמות השקולה ל-10x108 תאים אריתרואידים ב-4 מבחנות קוניות ב-450 g למשך 10 דקות והשליכו את הנוזל העליון.
      7. שטפו את 4 משקעי התאים ב-100 ml של מצע IMDM מושלם לכל אחד.
      8. תלו כל משקע תאים ב-250 ml מצע IMDM מושלם וחלקו 20 ml מתסמיך תאים זה לכל אחד מ-50 הבקבוקים המכילים תאי MS-5 ו-80ml מצע. הערה: בשלב זה, צריכים להיות לכם 50 בקבוקים עם תאי MS-5 בצפיפות גבוהה המכילים 100 ml תאים אריתרואידים בריכוז של 0.2x106 תא/מ"ל.
      9. הרחיבו את 5 הבקבוקים הנותרים של תאי MS-5 על ידי דילולם 1:5 לבקבוקי T-175 באמצעות טריפסין 0.05% EDTA. ריכוז התאים הסופי צריך להיות ~0.08x106 תא/מ"ל. הערה: יש להכין 20 בקבוקים של תאי MS-5 בריכוז של ~0.08x106 תא/מ"ל. הקפיאו את תאי ה-MS-5 הנותרים ואחסנו בחנקן נוזלי.
    • יום 16:
      1. ספרו תאים אריתרואידים עם Trypan blue כדי להחריג תאים מתים, ואספו את מספר התאים הדרוש (כלומר כ-4 ml מהתרבית) לבדיקות (ראו פסקה 6). הערה: צפיפות התאים צריכה להיות ~0.6x106 תא/מ"ל.
  5. שלב 4: ימים 18-26
    תאים אריתרואידים מרוכזים פי 3-4 כדי להגיע לריכוז סופי של 5-7x106 תא/מ"ל ונשמרים על שכבת MS-5 כדי לאפשר הבשלה. 10% FBS מתווספים למצע IMDM המושלם כדי לאפשר שימור טוב יותר של תאי דם אדומים מתורבתים (cRBCs).
    • יום 18:
      1. ספרו תאים אריתרואידים עם Trypan blue כדי להחריג תאים מתים, ואספו את מספר התאים הדרוש (כלומר כ-2 ml מהתרבית) לבדיקות (ראו פסקה 6). הערה: צפיפות התאים צריכה להיות ~1.7x106 תא/מ"ל.
      2. חממו מראש ב-37°C את 300ml של 1xPBS ו-1.5L של מצע IMDM מושלם (טבלה 2) המכיל 10% FBS.
      3. שטפו 15 בקבוקים של תאי MS-5 בצפיפות גבוהה עם 20 ml של 1xPBS לכל אחד, והוסיפו מיד 80 ml מצע IMDM מושלם טרי לכל בקבוק.
      4. סובבו תאים אריתרואידים (כלומר כמות השקולה ל-85x108 תאים) ב-450 g למשך 10 דקות, חברו וחלקו את המשקע ל-4 מבחנות קוניות.
      5. תלו כל משקע תאים ב-75 ml מצע IMDM מושלם המכיל 10% FBS וחלקו 20 ml מתסמיך תאים זה לכל אחד מ-15 הבקבוקים המכילים תאי MS-5 ו-80ml מצע. הערה: בשלב זה, צריכים להיות לכם 15 בקבוקים עם תאי MS-5 בצפיפות גבוהה המכילים 100 ml תאים אריתרואידים בריכוז של 6x106 תא/מ"ל.
      6. הרחיבו את 5 הבקבוקים הנותרים של תאי MS-5 על ידי דילולם 1:5 לבקבוקי T-175 באמצעות טריפסין 0.05% EDTA. ריכוז התאים הסופי צריך להיות ~0.08x106 תא/מ"ל. הערה: יש להכין 20 בקבוקים של תאי MS-5 בריכוז של ~0.08x106 תא/מ"ל. הקפיאו את תאי ה-MS-5 הנותרים ואחסנו בחנקן נוזלי.
    • יום 20:
      1. ספרו תאים אריתרואידים עם Trypan blue כדי להחריג תאים מתים, ואספו את מספר התאים הדרוש (כלומר כ-1.5 ml מהתרבית) לבדיקות (ראו פסקה 6). הערה: צפיפות התאים נשמרת ב-~1.5x106 תא/מ"ל.
    • יום 22:
      1. ספרו תאים אריתרואידים עם Trypan blue כדי להחריג תאים מתים, ואספו את מספר התאים הדרוש (כלומר כ-1.5 ml מהתרבית) לבדיקות (ראו פסקה 6). הערה: צפיפות התאים נשמרת ב-~1.5x106 תא/מ"ל.
      2. החליפו מצע והעבירו תאים אריתרואידים לשכבות חדשות של תאי MS-5 כפי שמתואר עבור יום 18.
    • יום 24:
      1. ספרו תאים אריתרואידים עם Trypan blue כדי להחריג תאים מתים, ואספו את מספר התאים הדרוש (כלומר כ-1.5 ml מהתרבית) לבדיקות (ראו פסקה 6). הערה: צפיפות התאים נשמרת ב-~1.5x106 תא/מ"ל.
    • יום 26:
      1. ספרו תאים אריתרואידים עם Trypan blue כדי להחריג תאים מתים, ואספו את מספר התאים הדרוש (כלומר כ-1.5 ml מהתרבית) לבדיקות (ראו פסקה 6). הערה: צפיפות התאים נשמרת ב-~1.5x106 תא/מ"ל.
      2. אספו תאי cRBCs שאינם נצמדים, נטולי גרעין ומעובדים במלואם עם המוגלובין. הערה: ניתן לשמר cRBCs בוגרים במצע SAGM (של MacoPharma) ב-4°C עד חודש אחד.
  6. בדיקות ותוצאות מייצגות
    הבדיקות הבאות מבוצעות בימים המצוינים כדי לאמת שגשוג תאים ותמיינות אריתרואידית תקינה. תוצאות מייצגות המוצגות באיורים הושגו באמצעות תאי CD34+ שבודדו מלוקפerez.
    1. ספירת התאים מבוצעת מדי יומיים. ראו תוצאה מייצגת של שגשוג תאים באיור 2.
    2. צביעת מורפולוגיה מסוג May-Grünwald Giemsa מבוצעת מדי יומיים תוך שימוש ב-0.05 x106 תאים עבור ימים 0 עד 8 ו-0.2x106 תאים עבור שאר הימים, לפי הנחיות יצרן צבע ה-Giemsa (טבלה 1). ראו תוצאות מייצגות באיור 3.
    3. בדיקות חצי-מוצקות מבוצעות בשכפול כדי למדוד פרוגניטורים המטופויים מדי יומיים מיום 0 עד יום 12, תוך שימוש ב-0.01x106 תאים לבדיקה, לפי הנחיות יצרן מצע Methocult החצי-מוצק (טבלה 1). ראו תוצאות מייצגות באיור 4.
    4. ניתוח של סמני התאים הבאים מבוצע מדי יומיים באמצעות FACS: CD34, CD36, CD71, GPA, LDS תוך שימוש ב-0.2 x106 תאים לבדיקה. ראו תוצאות מייצגות באיור 5.
    5. המוגלובין נמדד מדי יומיים על ידי צביעת בנזידין. ראו תוצאות מייצגות באיור 5.
    6. ביטוי גנים נלמד באמצעות RT-qPCR או מערך זיהוי (microarray) לאחר מיצוי RNA מ-1x106 תאים. ראו תוצאות מייצגות באיור 6B.

הערות על התוצאות:

איור 1 מפרט את הפרוטוקול להבחנה ex vivo של תאי CD34+ אנושיים לתאי דם אדומים בוגרים המכילים המוגלובין. במהלך ההבחנה האריתרואידית, התאים הם בעלי יכולת שגשוג גבוהה, כפי שמוצג באיור 2 שבו נצפתה הגברה של כ-8,000-מכפלות שהושגה באמצעות תאי CD34+ שבודדו מלוקאפרזיס. תאי CD34+ שבודדו ממח עצם הם בעלי יכולת שגשוג נמוכה מעט יותר עם הגברה של כ-6,000-מכפלות, בעוד שתאי CD34+ שבודדו מדם טבעה יכולים להגיע להגברה של 50,000-מכפלות. תאים בשלבים ספציפיים של ההבחנה מציגים גדלים ומורפולוגיות ניתנים לזיהוי, המוצגים באיור 3. שימו לב לתהליך הפינוי הגרעיני (enucleation) המתרחש בסוף ההבחנה החל מיום 20. ביום 26, כל התאים איבדו את הגרעינים שלהם (איור 3).

בדיקות ליצירת מושבות המוצגות באיור 4 משמשות לזיהוי פרוגניטורים המטופויטיים מוקדמים ומאוחרים במהלך הימים הראשונים של הדיפרנציאציה (יום 0 עד יום 8). בנוסף לפרוגניטורים אריתרואידיים (CFU-E ו-BFU-E), ניתן לראות כי פרוגניטורים של גרנולוציטים-מקרופאגים (CFU-GM) מיוצגים באופן משמעותי בתוך תאי CD34+ מוקדמים ביום 0. עם התקדמות הדיפרנציאציה, מספר ה-CFU-GM פוחת באופן משמעותי, וביום 6 הם הוחלפו לחלוטין על ידי פרוגניטורים אריתרואידיים מסוג BFU-E ו-CFU-E. חשוב לציין גם כי מהיום ה-4 ועד היום ה-6, פרוגניטורים אריתרואידיים מוקדמים מסוג BFU-E מוחלפים בהדרגה במקביליהם המובחנים יותר, CFU-E. עד יום 10, תאים אריתרואידיים איבדו למעשה את יכולתם ליצור מושבות.

לבסוף, ניתן לנטר את תהליך ההמטופויזה (erythropoiesis) באמצעות ביטוי של סממני פני שטח של התא, כפי שמוצג באיור 5. שימו לב ל: 1) האובדן הדרגתי של הסמן CD34 של תאי גזע/פרוגניטור המטופויטים; 2) הרכישה והאובדן הדרגתיים של הסמן CD36 של תאי הפרוגניטור; 3) הרכישה והאובדן הדרגתיים של הסמן CD71 של פרוגניטורים אריתרואידיים ורטיקולוציטים; ו-4) העלייה בסמן GPA של קדמונים אריתרואידיים ואריתרוציטים. סממנים נוספים של התמיינות אריתרואידית כוללים סינתזה של המוגלובין החל מהיום ה-8 (שנמדדה על ידי צביעת בנזידין-איור 5) והוצאת הגרעין מהתאים החל מהיום ה-20, כפי שנמדד על ידי אובדן צביעת ה-DNA LDS (איור 5). לבסוף, ניתן למדוד התמיינות אריתרואידית באמצעות RT-qPCR של סממנים מולקולריים כגון גורם השעתוק TAL1 (איור 6B) או גני ה-β-globin (נתונים לא מוצגים).

בדרך כלל, 1 ml של דם חבלה / לוקאפרזיס / מחול לשחול מספק 0.35x105 / 0.5x105 / 1.1x105 תאי CD34+, אשר יכולים באופן תיאורטי לייצר 1.7x109 / 0.4x109 / 0.7x109 תאי דם אדומים עם שיעורי התרבות בהתאמה של 50,000 / 8,000 / 6,000. כדי להשיג 50x106 תאי דם אדומים בסוף תהליך הדיפרנציאציה, תזדקקו לכ-50 ml של מצע תרבית.

חלק II. השתקה מתווכת לנטי-וירוס במהלך דיפרנציאציה אריתרואידית ex vivo

לנטיבירוס הוא כלי מועדף להעברה של גנים בתאי אדם ראשוניים (ראו למשל Amsellem et al. 9). לנטיבירוסים משמשים לעיתים קרובות להשקתה (knockdown) של גנים רלוונטיים בתאים ראשוניים באמצעות הובלה של shRNA ממוקד (ראו למשל Laurenti et al. 10). בפרוטוקול זה אנו מטרים את גורם השעתוק TAL1 בתאי אריתרואידים ראשוניים של אדם. shRNA בעל רצף מקרי (scrambled), שאינו תואם לשום גן ידוע, משמש כביקורת שלילית. ביטוי של GFP משמש להערכת יעילות ההחדרות (transduction).

1. הכנת חלקיקי וקטור לנטי-ויראלי

כדי להפיק חלקיקי לנטי-וירוס, מבצעים טרנספקציה משותפת של תאי כליה עובריים אנושיים מסוג 293T עם שלושה פלסמידים: אחד המכיל מערכת אריזת נגיפים של דור שני המקודדת לגנים של HIV-1 למעט env, vpr, vif, vpu ו-nef (כלומר psPAX2); אחד המקודד למעטפת של נגיף Vesicular Stomatitis G-pseudotyped (כלומר pMD2G); ווקטור לנטי-וירוסי המקודד לגן הרצוי (כלומר pBLOCK-it6-DEST(shTal1) המקודד ל-TAL1 shRNA, pBLOCK-it6-DEST(shScr) המקודד ל-scrambled shRNA או pWPIP המקודד ל-GFP) (טבלה 4). חלקיקי הלנטי-וירוס נאספים מנוזל העל של תרבית תאי 293T שעברו טרנספקציה.

כדי למנוע הדבקה לא רצויה של תאים, אנו מבצעים את כל ניסויי הלנטי-וירוס (הכנת הוירוסים וההדבקה) תחת מapay מוגדר ההנפרד מתרביות תאים אחרות. בנוסף, פסולת הנוצרת משימוש בלנטי-וירוס נשלחת להשמדה בנפרד. לנטי-וירוסים מהדור השני המתוארים בפרוטוקול זה הם חסרי יכולת שכפול ויש להתייחס אליהם כאורגניזמים ברמת בטיחות ביולוגית 2 (Biosafety Level 2). ייתכן שבמוסדות מסוימים קיימים נהלי בטיחות ספציפיים בנוגע ללנטי-וירוסים, ואנו ממליצים לפעול על פי הנחיות המוסד הקבועות.

כאן אנו מתארים פרוטוקול שיספק מספיק חלקיקי לנטי-וירוס להדבקת 1 עד 2 מיליוני תאי erythroid ראשוניים בכל שלב נתון של דיפרנציאציה. יש להתאים את הנפחים בהתאם להגדלה או להקטנה של הכמות. ראו טבלאות 4 ו-5 עבור הריאגנטים.

  1. טרנספקציה של תאי 293T באמצעות סידן פוספט.
    1. יום אחד לפני הטרנספקציה, זרע 13.2 x 106 תאי 293T ב-20 ml של מצע DMEM/High glucose המכיל 10% FBS ו-Pen/Strep בצלחית תרבית תאים של 15-cm. הערה: הדבר אמור לאפשר לתאים להגיע ל-70% קונפלואנסיות ביום הטרנספקציה. תוצאות מיטביות מושגות באמצעות תאי 293T במעבר נמוך (<20).
      אופציונלי: ניתן לצפות את הצלחיות בקולגן מסוג I או ב-Poly-L-lysine כדי להגביר את ההיצמדות של תאי 293T.
    2. שעתיים לפני הטרנספקציה, שאב את המצע מתאי 293T והוסף בעדינות 20 ml של מצע טרי שחומם מראש ל-37°C. הערה: בדרך כלל אנו מתחילים את הטרנספקציה בסוף היום.
    3. ערבב את הרכיבים הבאים בפסולה של 5 ml:
      • 44.8 μg וקטור ביטוי עבור הגן המבוקש (למשל shRNA או GFP - ראו טבלה 4)
      • 13.35 μg וקטור מעטפת pMD2.G.
      • 33.48 μg וקטור אריזה psPAX2.
      • הוסף מספיק H2O סטרילי כדי להביא את הנפח ל-1.116 ml.
    4. הוסף מספיק H2O סטרילי כדי להביא את הנפח ל-1.116 ml.
    5. הוסף 109.8 μl של CaCl2 בריכוז 2.5M וערבב באמצעות וורטקס.
    6. בתוך מבחנה קונית של 50 ml, הוסף 1.116 ml של באפר 2xHBS (טבלה 5).
    7. תחת ערבוב מתמיד בוורטקס, הוסף את תערובת ה-DNA בטיפות לבאפר 2xHBS.
    8. אפשר למשקע להיווצר בטמפרטורת החדר (RT) במשך 20 דקות (לא יותר מ-30 דקות).
    9. הוסף את תמיסת ה-2.3 ml בטיפות לצלחית המכילה את תאי 293T, סבב בעדינות והעבר את התאים לאינקובטור ב-37°C למשך 12-14 שעות.
    10. בבוקר למחרת, שאב את המצע והחלף אותו ב-20 ml של מצע טרי שחומם מראש ל-37°C.
  2. איסוף וריכוז של לנטיווירוס
    1. ארבעים ושמונה שעות לאחר הטרנספקציה, אסוף 20 ml מצע המכיל את הלנטיווירוס והעבר למבחנה קונית של 50 ml.
    2. הוסף 20 ml של מצע שחומם מראש ל-37°C לתאי 293T והחזר אותם לאינקובטור.
    3. סבב את העל-נוזל הוויראלי בצנטריפוגה ב-450 g למשך 10 דקות כדי להסיר שאריות תאים, והעבר למבחנה חדשה של 50 ml. לחלופין, ניתן לסנן את העל-נוזל דרך מסנן של 0.45μm. שמור את העל-נוזל הנקי ב-4°C.
    4. עשרים וארבע שעות לאחר מכן, אסוף את 20 ml המצע הנותרים. הערה: מצאנו כי טיטרי הוויראליים דומים בקירוב בשני האיסופים, כלומר 1x 106 TU/ml.
    5. כדי לרכז את הווירוסים, חלק את העל-נוזלים הוויראליים למבחנות Beckman OptiSeal (השתמש ב-32.4 ml על-נוזל למבחנה) וסבב בצנטריפוגה ב-100,000g למשך 1.5 שעות ב-4°C באמצעות רוטור מתנדנד. הערה: שיטות חלופיות לריכוז העל-נוזל הוויראלי כוללות צנטריפוגה ב-47,000 g למשך שעתיים או ב-3,000 g למשך 8 שעות. אין להקפיא את הווירוס לפני הריכוז. הקפאה תגרום לשקיעת חלבונים ותקשה על השהיית הווירוס.
    6. מיד לאחר האולטרסנטריפוגה, שאב את העל-נוזל לאט באמצעות פיפטה פלסטית של 10 ml והשלך אותו. הערה: היזהר לא להפריע למשקע שעלול להינתק בקלות מהמבחנה. לאחר השלכת 5ml הראשונים של העל-נוזל, אנו בדרך כלל חותכים את חלקו העליון של מבחנת האולטרסנטריפוגה כדי לסייע בהסרת העל-נוזל ככל האפשר, כך שנותרו כ-100-200 μl של מצע בתחתית המבחנה.
    7. הוסף 100 μl של 1xPBS, אפשר למשקע להתמוסס בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות, והשהה אותו על ידי פיפוט למעלה ולמטה 15-20 פעמים. הערה: בדרך כלל אנו מקבלים כ-200-300 μl של ויראלי ריכוז גבוה.
    8. את תכשיר הלנטיווירוס המרוכז מטיטרים על תאי NIH3T3 באמצעות פרוטוקול של Invitrogen (Block-it lentiviral RNAi Expression System). הערה: בדרך כלל אנו מקבלים טיטרים ויראליים של 2 עד 10x108 יחידות טרנסדוקציה (TU)/ml.
    9. ניתן להשתמש בווירוס כעת להדבקה (ראה פסקה 2), או לחלק לאליקוטים ולאחסן ב-80°C- למשך עד 6 חודשים. הערה: אין להעביד את תרחילי הוויראליים ביותר ממחזור הקפאה-הפשרה אחד. וירוסים יציבים למשך 4-5 שעות ב-37°C, 2-3 ימים בטמפרטורת החדר (RT) או שבוע אחד ב-4°C.

2. הדבקה לנטיווירלית של תאי אריתרואידים ראשוניים להחדרת גנים

  1. הדבקה
    ניתן להדביק תאי erythroid בעלי גרעין ביעילות בכל שלב של הדיפרנציאציה, כל עוד נעשה שימוש ב-MOI (multiplicity of infection) גבוה של 50-100. כאן אנו מתארים ניסוי טיפוסי שבו נעשה שימוש בלנטי-וירוסים המבטאים TAL1 shRNA או scramble shRNA כדי להדביק תאי erythroid בימים 8 ו-9 של הדיפרנציאציה תוך שימוש ב-MOI של 50 TU/cell. RNA מופק מדי 24 שעות כדי לאמת את רמת ה-KD של TAL1 באמצעות RT-qPCR. ביטוי GFP נמדד במקביל באמצעות FACS להערכת יעילות ההדבקה (ראו תוצאות מייצגות באיור 6).
    • יום 0:
      1. הכינו שלוש מבחנות קוניות של 15 ml המכילות כל אחת 1x106 תאי erythroid (כלומר, מבחנה אחת להשתקת TAL1, מבחנה אחת לביקורת scrambled שלילית, ומבחנה אחת לביקורת ביטוי GFP).
      2. שטפו את התאים עם 5 ml של מצע IMDM מועשר המכיל SCF ו-EPO (ראו חלק I), סובבו בצנטריפוגה ב-200 g למשך 5 min. והסירו כמה שיותר מהעליון.
      3. הוסיפו polybrene (טבלה 4) בריכוז סופי של 40 μg/ml לתוך תמיסת הוירוס המרוכזת.
      4. הוסיפו 100 μl של וירוס מרוכז (כלומר, 5x107 TU) המכיל polybrene לכל מבחנה של תאי erythroid.
      5. דגרו למשך 1 h באינקובטור ב-37°C וערבבו על ידי נקישה עם האצבע מדי 10 min. שימו לב: יש לבצע את ההדבקה בכמויות מינימליות של מצע כדי לאפשר ספיחה מקסימלית של הלנטי-וירוס לתאים. בנוסף, ערבוב מדי 10 min. מאפשר פיזור אחיד של הוירוס על פני התאים.
      6. הוסיפו 900 μl מצע IMDM מועשר המכיל SCF ו-EPO (טבלאות 2 ו-3) לכל מבחנה.
      7. העבירו כל דגימה לפלטת 6 באריים והניחו באינקובטור ב-37°C למשך 24 h.
    • יום 1: אספו את התאים למבחנות נפרדות של 15 ml, סובבו אותם ב-200 g למשך 5 min., הסירו את העליון וחזרו על פעולת ההדבקה (שלבים b עד g לעיל).
    • יום 2: שטפו את התאים ותלו אותם מחדש בריכוז של 0.2x106 cell/ml בתוך IMDM מועשר המכיל SCF ו-EPO והמשיכו כפי שמתואר בחלק I.
  2. תוצאות מייצגות
    איור 6A ממחיש את הפרוטוקול להדבקה בלנטי-וירוס של תאי erythroid ראשוניים ולאחריה מיצוי RNA. בניסוי אחד, הדבקנו תאי erythroid בלנטי-וירוס המייצר shRNA המכוון נגד גורם השעתוק TAL1 או ביקורת scrambled 11. איור 6B מראה שהצלחנו להשתיק 75% מתמלילי TAL1 בתאי erythroid ראשוניים. שימו לב גם לעלייה ברמת תמלילי TAL1 מיום 9 ליום 12 בביקורת ה-scrambled, דבר המדגיש את חשיבותו של גורם שעתוק זה במהלך דיפרנציאציה של תאי erythroid. בניסוי אחר, הדבקנו תאי erythroid בלנטי-וירוס המבטא את חלבון ה-GFP. איור 6C מראה ששלושה ימים לאחר ההדבקה, רוב תאי ה-erythroid (87%) מבטאים GFP כפי שנמדד באמצעות פלואורסצנציה תחת מיקרוסקופ ו-FACS. הדבר מעיד על יעילות הדבקה גבוהה בתאי erythroid ראשוניים. בעבר הדבקנו תאי CD34+ ביום 0 ביעילות הדבקה דומה (נתונים לא מוצגים). הפרמטר החשוב ביותר לטרנסדוקציה יעילה של תאים ראשוניים הוא שימוש ב-MOI גבוה (כלומר, לנטי-וירוסים מרוכזים). אם נעשה שימוש ב-MOI נמוך (כלומר, וירוס לא מרוכז), יעילות הטרנסדוקציה תרד.

3. תוצאות מייצגות

Positive isolation CD34+ HSCs diagram; immunomagnetic separation, serum-free erythroid differentiation.
איור 1. תמצית הפרוטוקול לבידוד ובידול אריתרואידי ex vivo של תאי גזע/פרוגניטורים המטופואטיים ראשוניים של בני אדם. (שלב 1) CD34+ תאים (בדרגת טוהר של 95 ± 3%) מבודדים מדם טבילה, ממחּולב עצם או מדם פריפריאלי אנושי שהופעל באמצעות G-CSF (לוקאפרזה), באמצעות ברירה אימונו-מגנטית חיובית. (שלב 2) CD34+ תאיים גודלו בתרבית נוזלית בהתאם לפרוטוקול בן ארבעה שלבים כפי שצוין.

גרף הגברת תאים; סקאלה לוגריתמית; ימי תרבית לעומת ניתוח מגמת גידול תאים.
איור 2. הגברת תאים במהלך פרוטוקול דיפרנציאציה אריתרואידית ex vivo. התוצאות מוצגות בסקאלה לוגריתמית. תוצאות מייצגות שהתקבלו מתאי CD34+ שבודדו באמצעות לוקאפרזיס.

תרשים של שלבי האריתרופויזה, תמונות מיקרוסקופיות העוקבות אחר התפתחות RBC לאורך 26 ימים.
איור 3. ניתוח מורפולוגי של תאים במהלךו של בידול אריתרואידי ex vivo. התאים נצבעו בריאגנט May-Grünwald-Giemsa בנקודות הזמן המצוינות במהלך הבידול (הגדלה x 40). HSC: תאי גזע/פרוגניטורים המטופואטיים; BFU-E: יחידות יוצרות התפרצות – אריתרואידיות; CFU-E: יחידות יוצרות מושבות – אריתרואידיות; Pro EB: פרו-אריתרובלסטים; Baso EB: אריתרובלסטים בסיליפיליים; Poly EB: אריתרובלסטים פוליכרומטופיליים; Ortho EB: אריתרובלסטים אורתוכרומטופיליים; RET: רטיקולוציטים; RBC: תאי דם אדומים.

תרשים בדיקת מצע חצי מוצק; צמיחת תאי מקור CFU-GM, BFU-E, CFU-E; ימי תרבית תאים; השוואת תמונות.
איור 4. בדיקות תאים יוצרי מושבות (CFC) לזיהוי וכימות של תאי מקור המטופואטיים. בנקודות הזמן המצוינות, 104 תאים נזרעו במצע מתילצלולוזה חצי מוצק בנוכחות ציטוקינים אנושיים רקומביננטיים: rh SCF, rh GM-CSF, rh G-CSF, rh Il-3, rh EPO לתמיכה בצמיחה אופטימלית של תאי מקור אריתרואידיים (BFU-E ו-CFU-E) ותאי מקור גרנולוציטיים-מקרופאגיים (CFU-GM). BFU: burst forming units; CFU: colony forming units. מוצגות גם תמונות טיפוסיות של BFU-E ו-CFU-E. שימו לב לצבע החום-אדום הנובע מהמוגלובינציה של BFU-E ו-CFU-E.

גרפים של בידול המטופויטי המראים סמני תאים CD34, CD36, CD71, GPA, Benzidine, LDS לאורך זמן.
איור 5. קינטיקה של סמנים המטופויטיים/אריתרואידיים במהלך בידול אריתרואידי ex vivo. בנקודות הזמן המצוינות, נאספו 2x105 תאים ונבדקו לביטוי של הסמנים המצוינים באמצעות FACS (CD34, CD36, CD71, GPA ו-LDS) או באמצעות מיקרוסקופיה (Benzidine). הטיות מייצגות אחוזים של תאים חיוביים. CD34: גליקופרוטאין טרנס-ממברנלי, המצוי בתאי גזע/פרוגניטורים המטופויטיים אנושיים; CD36: רצפטור לתרומבוספונדין, המצוי בתאי פרוגניטורים; CD71: רצפטור לטרנספרין, המצוי בפרוגניטורים אריתרואידיים וברטיקולוציטים; GPA: גליקופורין A, המצוי באב-תאים אריתרואידיים ובאריתרוציטים; Benzidine: צבע להמוגלובין; LDS: סטיריל צבע לייזר, צבע ל-DNA.

ציר זמן להדבקת lentivirus shRNA, גרף עמודות של ביטוי TAL1 mRNA, מיקרוסקופיה של GFP, ציטומטריה של זרימה.
איור 6. העברה של גנים באמצעות lentivirus בפרואריתרובלסטים ראשוניים של בני אדם. (A) ציר זמן להשראת knockdown (KD) של TAL1 בפרואריתרובלסטים ראשוניים באמצעות מערכת להעברת גנים על ידי lentivirus. (B) ה-knockdown של TAL1 בוצע באמצעות anti-Tal1 shRNA שהועבר על ידי lentivirus (TAL1 KD) או shRNA בקרה אקראי (Scr). קינטיקה של רמת הטרנסקריפט של TAL1 mRNA נמדדה באמצעות RT-qPCR. ביטוי הטרנסקריפט של TAL1 מוצג ביחס ל-18S RNA. (C) GFP שהועבר על ידי lentivirus נבדק באמצעות מיקרוסקופיה (פאנל שמאלי) או FACS (פאנל ימני). 87% מהתאים היו GFP חיוביים.

4. חומרים

ריאגנטאנא ספק את טקסט המקור באנגלית כדי שאוכל לתרגמו לעברית עבורך בהתאם להנחיות המקצועיות שצוינו.מספר קטלוגי
RPMI 1640 סיגמאR8758
קולגנאז BRoche מדעי היישום11088807001
DNase IסיגמאD5025-15KU
מסנני טרום-הפרדה (רשת ניילון 30 מיקרון)Miltenyi Biotec Inc130-041-407
Ficoll-paque PLUS GE Healthcare Bio-Sciences17-1440-03
EasySep 10x Red Blood Cells Lysis BufferStemCell Technologies20120
ערכת MicroBead ל-CD34Miltenyi Biotec Inc130-046-703
עמודי LS Mini-MacsMiltenyi Biotec Inc130-042-401
autoMACS Running Buffer-MACS Separation BufferMiltenyi Biotec Inc130-091-221
מפריד MiniMACSMiltenyi Biotec Inc130-042-102
תאי סטרומה ממחית עצם של עכבר MS-5 (יש לבדוק באופן קבוע זיהום במיקופלסמה)DSMZACC 441
תמיסת Trypan Blue (0.4%)סיגמאT8154
MEM Alpha+GlutaMAX Gibco Invitrogen 32571
טריפסין 0.05%/EDTAThermoScientific J101521
צביעת מאי-גרונוולד-ג'ימזה (May Grunwald Giemsa) Biostain Ready Reagents Ltd RRSP54
בדיקות תאים יוצרי מושבות (CFC) באמצעות Methocult לתאים אנושיים StemCell Technologies 04044

טבלה 1.

רכיבתמיסת מקורנפח ל-600 ml
IMDMSigma I3390443.4 ml
Pen/Strept 1% (vol/vol)Gibco 103786ml
L-glutamine 4x10-3M200mM (Gibco 25030)12 ml
Inositol 40μg/ml4mg/ml (Sigma I5125)
הכנה: להמיס 28 mg אבקה ב-7 ml IMDM ולסנן לסטריליזציה - יציב למשך שבוע ב-4°C.		6ml
Folic acid 10μg/ml1 mg/ml (Sigma F7876)
הכנה: להמיס 7 mg אבקה ב-7 ml IMDM שחומם מראש ולסנן לסטריליזציה - יציב למשך שבוע ב-4°C. יש לחמם מראש לפני השימוש.		6ml
Monothioglycerol 1.6x10-4M0.16M (Sigma M6145)
הכנה: להמיס 10 μl של תמיסת מקור בריכוז 11.56M ב-712 μl IMDM ולסנן לסטריליזציה - יציב למשך שבוע ב-4°C.		0.6ml
Ferrous nitrate 90 ng/ml18μg/ml (Sigma 8508)
הכנה: להמיס 1.8 mg ב-1ml מים מזוקקים. לקחת 0.1 ml, להוסיף 9.9 ml IMDM ולסנן לסטריליזציה - יציב למשך שבוע ב-4°C.		3ml
Ferrous sulfate 900 ng/ml180 μg/ml (Sigma F8633)
הכנה: להמיס 18 mg ב-1ml מים מזוקקים. לקחת 0.1 ml, להוסיף 9.9 ml IMDM ולסנן לסטריליזציה - יציב למשך שבוע ב-4°C.		3ml
Bovine serum albumine-Insulin-Transferrin (BIT)
20% (vol/vol)		StemCell Technologies 9500120 ml

טבלה 2.

רכיבתמיסת מקורנפח להוספה ל-100 ml של IMDM מועשר (טבלה 2)
הידרוקורטיזון (HC) 10-6 M10-4 M (Sigma H2270)
הכנה : המסס 5mg אבקה ב-1.03ml IMDM. קח 0.1 ml, הוסף 9.9 ml IMDM ובצע סינון סטרילי. יציב למשך שבוע ב-4°C. 		1ml
גורם תאי גזע (SCF) 100ng/ml100 μg/ml (Cedarlane 4327-50)
הכנה: המסס 50 μg אבקה ב-500 μl PBS+0.1% BSA ובצע סינון סטרילי. הכן אליקוטיות של 100 μl ושמור ב-20°C- .		100 μl
אריתרופואטין (EPO) 3 IU/ml100 μg/ml השווה ל-12,000UI/ml (Feldan FB03-10-290)
הכנה: המסס 50 μg אבקה ב-500 ml PBS+0.1% BSA ובצע סינון סטרילי. הכן אליקוטיות של 25 ml ושמור ב-20°C- .		25 μl
אינטרלוקין 3 (IL3) 5 ng/ml100 μg/ml (Feldan FB03-10-330)
הכנה: המסס 10 μg אבקה ב-100 μl PBS+0.1% BSA ובצע סינון סטרילי. הכן אליקוטיות של 5 ml ושמור ב-20°C- .		5 μl

טבלה 3.

ריאגנטמקורסימוכין
תאי 293T
(בדיקה סדירה לזיהום במיקופלסמה) 		ATCCCRL-11268
DMEM/High GlucoseThermoScientificSH30243.01
הקסדימתרין ברומיד (Polybrene)SigmaH9268-5G
מבחנות אולטרה-צנטריפוגה OptiSealBeckman Coulter361625
פלסמיד psPAX2Addgene (מעבדתו של D. Trono)12260
פלסמיד pMD2.GAddgene (מעבדתו של D. Trono)12259
פלסמיד pBLOCK-it6-DEST (shTal1)רצף shRNA של Tal1 ששוכפל לתוך פלסמיד pBLOCK-it6-DEST מבית InvitrogenPalii et al. EMBO J.
פלסמיד pBLOCK-it6-DEST (shScr)רצף shRNA מקרי (scrambled) ששוכפל לתוך פלסמיד pBLOCK-it6-DEST מבית InvitrogenPalii et al. EMBO J.
פלסמיד pWPIAddgene (מעבדתו של D. Trono)12254

טבלה 4.

בופרהכנהריכוז סופי
2xHBS
  • 1.6 g NaCl
  • 1.3 g HEPES
  • 0.04 g Na2HPO4(7H2O)
  • הוסף מי Milli-Q.
  • כוון את ה-pH בדיוק ל-7.11-7.13 על ידי הוספת תמיסת NaOH והשלם במי milli-Q עד לנפח של 100 ml.
  • דייק את ה-pH ל-7.11-7.13.
  • סנן לסטריליזציה, חלק לאליקוטיות של 10 ml ואחסן ב-200C-
  • 280 mM
  • 100 mM
  • 1.5 mM
CaCl2
  • 2.77 g anhydrous CaCl2
  • המס ב-10 ml מי Milli-Q.
  • סנן לסטריליזציה, חלק לאליקוטיות של 1 ml ואחסן ב-20°C-
  • 2.5M
MS30
  • 25ml של [2M] Tris pH8.0
  • 5ml של [0.5M] EDTA
  • 300ml של Glycerol
  • 50mM
  • 2.5mM
  • 30% (v/v)

טבלה 5.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מספר שיטות שימשו בעבר להבדיל תאים erythroid בתרבות עם דרגות משתנות של הצלחה. לדוגמה, כמה פרוטוקולים ללא תרבות משותפת על MS-5 מאפשרת הרחבה של תאים erythroid אך אינם יעילים בהפקת לבגרות מלאה בתאי דם אדומים enucleated 12-17. בעוד שיטות אחרות לאפשר enucleation יעיל, זה על חשבונם של התפשטות 18,19. השיטה השתמשנו כאן, שפותחה לראשונה על ידי המעבדה Douay 6, המשלבת צעד ראשון תרבות נוזלי, אשר מאריך הגברה התא במהלך השלבים המוקדמים של בידול erythroid ובכך מספק ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

אנו מודים ל Douay ו MC Giarratana (אוניברסיטת פריס VI, צרפת) עצה על בידול vivo erythroid לשעבר, אלן ד 'וה' אטקינס (OHRI, קנדה) למתן דגימות דם (שהושג לפי מחקר החולים אוטווה אתיקה עמוד # 2007804-01H), ד Trono (אקול פוליטכניק הפדרלי דה לוזאן) עבור מתן וקטורים lentiviral ו FJ דילוורת' (OHRI, קנדה) עבור אנושות לקרוא את כתב היד. פרויקט זה מומן על ידי מענק CIHR (MOP-82813) כדי MBCGP הוא מקבל מלגת קרן מחקר אונטריו הדרכה Regulomics חישובית דוקטורים. MB הקתדרה למחקר בקנדה בתקנה של ביטוי גנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

מקורות

  1. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
  2. Kim, S. I., Bresnick, E. H. Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles. Oncogene. 26, (2007).
  3. Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells. Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).
  4. Weiss, M. J., Yu, C., Orkin, S. H. Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line. Mol Cell Biol. 17, 1642-1651 (1997).
  5. Lozzio, B. B., Lozzio, C. B., Bamberger, E. G., Feliu, A. S. A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin. Proc Soc Exp Biol Med. 166, 546-550 (1981).
  6. Giarratana, M. C. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
  7. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, (2006).
  8. Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
  9. Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F., Dubart-Kupperschmitt, A. Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny. Mol Ther. 6, 673-677 (2002).
  10. Laurenti, E. Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo. Stem Cells. 28, 1390-1398 (2010).
  11. Palii, C. G. Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages. EMBO J. 30, 494-509 (2011).
  12. Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A., Rachmilewitz, E. A. Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture. Blood. 73, 100-103 (1989).
  13. Wada, H. Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system. Blood. 75, 505-511 (1990).
  14. Sui, X. Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells. J Exp Med. 183, 837-845 (1996).
  15. Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M. Y., Zenke, M. Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro. Blood. 92, 3658-3668 (1998).
  16. Lindern, M. von The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro. Blood. 94, 550-559 (1999).
  17. Freyssinier, J. M. amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors. Br J Haematol. 106, 912-922 (1999).
  18. Malik, P. An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells. Blood. 91, 2664-2671 (1998).
  19. Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation. Blood. 103, 4310-4316 (2004).
  20. Mazurier, F. Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein. Gene Ther. 5, 556-562 (1998).
  21. Salmon, P. High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors. Blood. 96, 3392-3398 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

בידוד תאים חיוביים ל-CD34תרבית משותפת של תאי סטרומהפרוטוקול הדבקה בלנטי-וירוסניתוח ביטוי GFPתיקוף השתקה באמצעות RT-qPCRגורם השעתקה TAL1פרוטוקול התמיינות אריתרואידית
Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.