התמרה של תאים אנושיים עם Lentivirus פולימר-ומורכבת Ecotropic עבור Enhanced biosafety

סיכום

Lentiviruses הם כלי מחקר חשוב לחקר תפקוד הגנים, אולם החוקרים מומלץ להימנע הייצור של קידוד lentivirus pantropic ידוע או אונקוגנים חשד. כחלופה, אנו מציגים פרוטוקול בטוחה יותר לשימוש lentivirus ecotropic על תאים אנושיים שונה לבטא את mSlc7a1 קולטן ecotropic.

תקציר

גזע סרטניים ביולוגיה מחקרים תא לעיתים קרובות דורשים התמרה ויראלית של תאים אנושיים עם אונקוגנים ידועים או חשודים, העלאת בעיות בטיחות מרכזי אנשי המעבדה. Lentiviruses Pantropic, כגון נפוץ VSV-G pseudotype, הם כלי רב ערך ללימוד פונקציה גן משום שהם יכולים transduce סוגי תאים רבים, כולל תאים שאינם מתחלקים. עם זאת, החוקרים עשויים לרצות להימנע ייצור צנטריפוגה של וירוסים pantropic קידוד אונקוגנים עקב גבוה טיפול biosafety דרישות לרמה בעיות בטיחות. אונקוגנים מספר חזק, כולל c-myc ו SV40 אנטיגן T גדול, ידועים כדי לשפר את הייצור של המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSC). כל שאר ידוע iPSC וישכנע שינויים גנטיים (OCT4, Sox2, KLF4, Nanog, LIN28, ואובדן של תפקוד p53) יש גם קישורים סרטן, מה שהופך אותם דאגה בטיחות גבוהה יחסית גם כן.

בעוד אלה הקשורים לסרטן וירוסים מועילים ללמוד תכנות מחדש הסלולר pluripotency, יש להשתמש בהן בבטחה. כדי לטפל בבעיות אלה biosafety, אנחנו מדגימים שיטה התמרה של תאים אנושיים עם lentivirus ecotropic, עם דגש נוסף על עלות מופחתת וטיפול נוח. יש לנו המיוצר lentivirus ecotropic עם כייל גבוה מספיק כדי transduce יותר מ 90% של קולטן להביע תאים אנושיים שנחשפו לנגיף, תוקף את היעילות של גישה זו.

Lentivirus מרוכזת לעתים קרובות על ידי ultracentrifugation, אך תהליך זה לוקח כמה שעות יכול לייצר אירוסולים זיהומיות לחוקרים ביו האדם. כחלופה, חלקיקים נגיפיים יכול להיות משקעים בצורה בטוחה יותר על ידי תאים complexation עם סולפט כונדרואיטין ו polybrene (CS / PB). טכניקה זו מגבירה את titer ויראלי פונקציונלי עד פי 3 בתאים ביציבות לבטא קולטן רטרווירוס Murine, עם הזמן הוסיף העלות זניחה. התמרה של fibroblasts עורי האנושי (HDFS) היא משופרת מקסימאלי באמצעות CS / PB ריכוזים של פי כ -4 נמוך יותר משווי אופטימלי שדווח קודם לכן על שורות תאים סרטניים, טוען כי ריכוז הפולימר צריך להיות טיטרציה עבור סוג תא היעד של עניין. לפיכך, אנו מתארים את השימוש methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium ברומיד (MTT) כדי assay רעילות פולימר בסוג התא החדש. אנו צופים הכדאיות המקבילה של HDFS לאחר התמרה ויראלית או באמצעות complexation פולימר או את המינון הסטנדרטי של polybrene (PB, 6 מיקרוגרם / מ"ל), המעיד רעילות חריפה מינימלית.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש lentivirus ecotropic עבור overexpression של אונקוגנים בתאים אנושיים, הפחתת סיכונים biosafety והגדלת שיעור התמרה. אנחנו גם מדגימים את השימוש complexation פולימר כדי לשפר התמרה תוך הימנעות אירוסול יוצרי צנטריפוגה של חלקיקים נגיפיים.

פרוטוקול

1. ייצור, קציר והקפאה של לנטי-וירוס

1. התייעץ עם קצין הבטיחות המוסדי לפני תחילת הפרוטוקול, ופעל לפי הנחיות הבטיחות המומלצות על ידו.
2. יום 1. התחל עם תאי 293T בריאים בעלי צמיחה מהירה להפקת וירוס. זרע את התאים בריכוז של 5 x 10⁶ תאים לכל צלחת 10 cm. השתמש במצע 293T ללא אנטיביוטיקה (DMEM עם גלוקוז גבוה, 10% FBS ו-4 mM L-glutamine) להפקת הווירוס.
3. יום 2. בשעות אחר הצהריים המאוחרות, בצע טרנספקציה לתאי 293T באופן הבא (המספרים המצוינים הם עבור צלחת 10 cm אחת). המתן עד שכל الريאגנטים יגיעו לטמפרטורת החדר. טפטף 375 μl OptiMEM לתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה, ולאחר מכן הוסף 25 μl Fugene HD. הימנע ממגע של Fugene לא מהול עם דופן המבחנה.
4. במבחנה למיקרו-צנטריפוגה, ערבב:
   • 5 μg פלסמיד העברה (Slc7a1, וקטור מטרה, או וקטור בקרה פלואורסצנטי)
   • 3.75 μg פלסמיד אריזה (pCMV-dR8.91 או psPax2)
   • 1.25 μg פלסמיד מעטפת (pMD2.G עבור פנטרופי, pHCMV-EcoEnv עבור אקוטרופי)
   • OptiMEM ללא סרום עד לנפח של 100 μl
5. אחד את שתי המבחנות והדגר את התערובת במשך 20-30 דקות בטמפרטורת החדר.
6. החלף את המצע על תאי ה-293T ל-10 ml מצע 293T טרי ללא אנטיביוטיקה. הוסף את תערובת ה-Fugene/פלסמיד בטיפות לצלחת והדגר למשך לילה ב-37°C, 5% CO₂.
7. יום 3. החלף את המצע על תאי ה-293T ל-10 ml מצע 293T טרי ללא אנטיביוטיקה. פעל בעדינות, מכיוון שתאי 293T נצמדים באופן חלש בלבד ועשויים להיפרד מהמשטח אם המצע יטפטף בעוצמה רבה מדי על השכבה החד-שכבתיות (monolayer). הדגר למשך יומיים באינקובטור לח לצורך הפקת הווירוס.
8. יום 5. אסוף את הווירוס וסנן בעזרת מסנן 0.45 mm בעל קישוריות חלבון נמוכה. השתמש בו מיד או חלק לאליקוואוטים לשימוש חד-פעמי והקפא ב-80°C-. יש לבצע תיטור מחדש לווירוס פנטרופי ואקוטרופי לאחר אחסון של שישה חודשים וחודש אחד, בהתאמה.
9. בצע תיטור לווירוס באופן הבא, תוך שימוש בתאים הרגישים יחסית לטרנסדוקציה. בצע טרנסדוקציה לתאים עם וירוס בקרה פלואורסצנטי למשך לילה באמצעות דילולים סדרה (למשל 1:10, 1:100, 1:1000) במצע טרי עם 6 μg/ml PB. החלף למצע טרי למחרת. המתן יומיים לאחר הטרנסדוקציה עד שהתאים יתחילו לבטא את החלבון הפלואורסצנטי, ולאחר מכן קבע את חלק התאים שעברו טרנסדוקציה באמצעות FACS. חשב את התיטור ביחידות טרנספורמציה (TU) למל', בהתבסס על דילולים המניבים < 15% טרנסדוקציה כדי למזער אירועי טרנסדוקציה מרובים.
   

2. טרנסדוקציה של תאי מטרה אנושיים באמצעות הקולטן הרטרו-ויראלי העכברי Slc7a1

1. בחרו בריבוי זיהום (MOI) = 2 כדי להבטיח שרוב התאים יעברו טרנסדוקציה. עבור תאי מטרה העמידים לטרנסדוקציה, כגון HDFs, יידרש MOI גבוה יותר; אנו מדללים את העליון הויראלי ביחס של 1:2 בלבד כדי להשיג טרנסדוקציה של מרבית התאים.
2. בצעו טרנסדוקציה לתאי המטרה למשך לילה עם עליון ויראלי המדולל במצע תרבית רענן עם 6 μg/ml PB, אשר מגביר את הטרנסדוקציה על ידי שיפור האינטראקציה האלקטרוסטטית בין הווירוס לתא המטרה.¹ באופן אידיאלי, יש להשתמש בנפח מינימלי של וירוס, כגון 1 ml עבור צלחת של 35 mm, מכיוון שדיפוזיה היא גורם מגביל ביעילות הטרנסדוקציה.
3. תרבתו את התאים למשך 48 שעות לפחות לאחר הסרת הווירוס בטרם ביצוע טרנסדוקציה עם וירוס אקוטרופי, וזאת כדי להבטיח ביטוי מספיק של הקולטן Slc7a1.
4. (אופציונלי) ניתן להשתמש בבלאסטיצידין כדי לבחור תאים שעברו טרנסדוקציה יציבה המבטאים Slc7a1, במידה ורצוי. יש להכין מראש עקומת הריגה של בלאסטיצידין כדי לקבוע את הריכוז האפקטיבי הנמוך ביותר, בדרך כלל בין 2 – 10 μg/ml, ההורג את כל תאי המטרה שלא עברו טרנסדוקציה תוך 7 ימים. כיומיים לאחר הסרת וירוס ה-Slc7a1, העבירו את התאים שעברו טרנסדוקציה למצע המכיל בלאסטיצידין. תרבתו את התאים במצע המכיל בלאסטיצידין למשך 7 ימים, בנקודה זו כל התאים שנותרו יבטאו באופן יציב את הקולטן הרטרוויראלי, ואז ניתן יהיה לבצע להם טרנסדוקציה עם וירוס אקוטרופי וכן לשמר אותם לשימוש עתידי כשורה יציבה המבטאת Slc7a1.

3. טיטרציה של קומפלקס פולימר לקביעת רעילות

1. יום 1. זרקו תאים בריכוז של 5000 cells/well בלוח 96-well, תוך הקצאת לפחות שלוש שכמיות לכל קבוצה ניסיונית. כללו תאים שאינם טרנסדוקטים במצע מלא כדי לספק ערך בסיס לתאים בריאים, וכן דגימות של תאים במצע נטול סרום כדי להשרות עיכוב גדילה כביקורת. במקביל, זרקו תאים בפורמט מתאים (כגון לוח 24-well) לצורך ניתוח של יעילות הטרנסדוקציה בכל תנאי ניסיוני באמצעות מיקרוסקופ או FACS.
2. יום 2. בצעו טרנסדוקציה לתאים בלוחות שהוכנו הן עבור ניתוחי MTT והן עבור FACS באמצעות וירוס המקודד ל-GFP, ב-MOI של 0.5 כדי לטרנסדוקט כ-40% מתאי המטרה. בחנו ריכוזים שונים של CS/PB (למשל 50, 100, 200, 400, 600, ו-800 mg/ml של כל רכיב), וכן 6 μg/ml PB, כדי לקבוע את הכמויות האופטימליות. הכינו קומפלקסים פולימריים כפי שמתואר בחלק 4, להלן.
3. יום 3. הסירו את המצע המכיל וירוסים והחליפו אותו במצע טרי. החזירו את הלוחות לאינקובטור לח.
4. יום 5. נתחו את לוח ה-FACS כדי לקבוע את יעילות הטרנסדוקציה עבור כל ריכוז פולימר.
5. יום 6. הסירו את המצע מכל הבארים בלוח ה-MTT והחליפו ב-100 μl תמיסת MTT (ריכוז 1 mg/ml MTT במצע מלא). דגרו למשך שלוש שעות באינקובטור לח כדי לאפשר את חיזור ה-MTT במיטוכונדריה של תאים פעילים מטבולית.
6. הסירו את תמיסת ה-MTT והחליפו ב-200 ml מממס MTT (0.1 N HCl, 0.1% Igepal CA-630 באיזופרופנול).
7. דגרו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או עד שכל משקע הפורמזאן הסגול של ה-MTT יתמוסס. מדדו את הבליעה במקרא מיקרו-לוחות ב-570 nm, תוך הפחתת קריאת הרקע ב-690 nm.
8. בחרו את ריכוז הפולימר האופטימלי המניב שיפור מרבי בטרנסדוקציה, כפי שנקבע ב-FACS, עם השפעה מינימלית על הפעילות המטבולית, כפי שנקבע ב-MTT. עבור HDFs, בחרנו 100 μg/ml CS/PB בהתבסס על הנתונים המוצגים בתוצאות המייצגות, להלן.

4. טרנסדוקציה אקוטרופית באמצעות קומפלקסציה של פולימרים

1. הכינו תמיסות סטוק שעברו סינון סטרילי של PB ושל chondroitin sulfate בריכוז 20 mg/ml במים. חלקו לאליקוטים ואחסנו ב-20°C-.
2. העבירו בעזרת פיפטה על-נוזל ויראלי (viral supernatant) לשפופרת מיקרוצנטריפוגה ודללו לריכוז הסופי הרצוי (למשל MOI של 2) באמצעות מצע גידול טרי. הוסיפו בהדרגה נפחים שווים של PB ושל chondroitin sulfate (הריכוזים שנקבעו בשלב 3 לעיל), תוך נקישה על השפופרת לערבוב לאחר כל הוספה. התערובת הוויראלית תהפוך למעורפלת באופן מיידי כתוצאה מהיווצרות משקעים. הדגירו את התערובת הוויראלית בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כדי לאפשר היווצרות של קומפלקסים.
3. הסירו את המצע מהתאי המטרה המבטאים את הרצפטור, החליפו אותו בתערובת הוויראלית, והדגירו למשך לילה ב-37°C, 5% CO2. לאחר הסרת התערובת הוויראלית, שטפו את פני התאים פעמיים עם PBS כדי לסייע בהסרת הקומפלקסים הוויראליים. הסרה מלאה אינה הכרחית; לא צפינו בהשפעות שליליות על בריאות התאים כתוצאה מקומפלקסי פולימר שנותרו.

5. אימות הספציפיות של טרנסדוקציה אקוטרופית

1. בעת ייצור נגיף אקוטרופי (ecotropic virus) לראשונה, מומלץ מסיבות בטיחותיות לוודא שהנגיף אינו מסוגל להעביר גנים (transduce) לתאים אנושיים שאינם שעברו שינוי. בצעו טרנסדוקציה לתאים אנושיים באמצעות לנטיווירוס אקוטרופי בריכוז גבוה יחסית (דילול של פי 1 עד 2 בלבד של supernatant נגיפי במצע טרי) למשך לילה, עם 6 μg/ml PB או ריכוז CS/PB אופטימלי.
2. הסירו את המצע המכיל את הנגיף והחליפו אותו במצע טרי. לאחר דגירה של התאים למשך יומיים, אששו את ביטוי הגן המועבר (transgene) באמצעות FACS עם וקטורים פלואורסצנטיים ו/או באמצעות RT-PCR עם פריימרים ספציפיים לגן המועבר.

6. תוצאות מייצגות:

איור 1A מציג את תהליך ייצור הלנטיבירוס, ואיור 1B מציג טרנסדוקציה של תאי אדם באמצעות לנטיבירוס אקוטרופי, כולל טרנסדוקציה מקדימה עם הקולטן למעבר רטרובירוס עכברי Slc7a1. לצורך תיתוּר (titering) של הווירוס, אנו משתמשים בשורת תאי רבדומיוסרקומה אנושית שעברו טרנסדוקציה יציבה של Slc7a1 (Slc-hRMS). בעת שימוש בווקטורי בקרה פלואורסצנטיים לניטור יעילות הטרנסדוקציה, אנו משיגים באופן שגרתי יעילות טרנסדוקציה של > 90% של תאי Slc-hRMS עם וירוס אקוטרופי, כפי שמוצג באיורים 2A ו-2B. שיעורי הטרנסדוקציה של HDFs הם בדרך כלל נמוכים יותר מכיוון שהתאים לא עברו סלקציה של blasticidin לביטוי הקולטן (איור 2C). הטיטרים של לנטיבירוס אקוטרופי הם בדרך כלל 10-20% מהווירוס הפסאודוטיפי ל-VSV כאשר הם נמדדים ב-Slc-hRMS (איור 2D).

מחזור הקפאה-הפשרה אחד מפחית את הטיטר של נגיף אקוטרופי ב-3% - 16%, ערך השווה לאובדן הטיטר במהלך מחזור הקפאה-הפשרה בודד של נגיף פסאודו-טיפד VSV (p > 0.05). בניגוד לדיווחים קודמים,² לא הבחנו בהשפעה חיובית של הקפאה מהירה בקרח יבש על טיטר הנגיף. במקום זאת, השגנו טיטרים גבוהים יותר לאחר הפשרה עבור שני סוגי הפסאודו-טיפים פשוט על ידי הנחת מבחנות הנגיף במקפיא -80°C (נתונים לא מוצגים).

בדיקת חיוניות MTT מאפשרת זיהוי רגיש של מעצר גדילה בתאי מטרה. טרנסדוקציה באמצעות וירוס בתוספת ריכוזים של CS/PB עד 800 μg/ml אינה משפיעה על חילוף החומרים של HDF (איור 3A). חשיפה ל-CS/PB ללא וירוס אינה גורמת גם היא להשפעה רעילה על התאים (נתונים לא מוצגים). ניתוח FACS של HDFs שעברו טרנסדוקציה עם וירוס בתוספת ריכוזים שונים של CS/PB מראה שיפור בטרנסדוקציה בהשוואה ל-PB לבדו (איור 3B). השיפור המקסימלי מופיע בריכוז של 100 μg/ml CS/PB (איור 3C), נמוך פי כמה מהערכים שדווחו בעבר.³ לפיכך, חשוב לבצע אופטימיזציה של התנאים עבור כל סוג תא מטרה נתון.

קומפלקסציה עם CS/PB משפרת את הטיטר הנצפה פי 3 בקירוב ב-Slc-hRMS (איור 4A, p < 0.01). בפועל, הדבר מניב השפעה גדולה יותר על יעילות התעתוק בריכוזי נגיף נמוכים מאשר בריכוזים גבוהים יותר (איור 4B), מה שנובע ככל הנראה מתאים שעברו תעתוק מרובה ומרוויה של קולטנים בריכוזי נגיף גבוהים יותר.

הדבקה (Transduction) באמצעות נגיף אקוטרופי היא ספציפית לתאים המבטאים רצפטור לרטרווירוס של עכבר. בעת הדבקה של תאי אדם לא מודיפיים באמצעות נגיף אקוטרופי, לא צפינו פלואורסצנציה הגבוהה מהרקע של תאים שאינם מדובקים, בין אם בשימוש ב-PB או ב-CS/PB, כפי שמוצג באיור 5A. בבדיקה מיקרוסקופית, תאי HDF אינם מראים הדבקה בהיעד רצפטור (איור 5B), בעוד שהדבקה מוקדמת של הרצפטור מובילה לתאים פלואורסצנטיים (איור 5C).

איור 1. תרשים סכמטי של (A) תהליך ייצור הנגיף ו-(B) טרנסדוקציה של תאי אדם עם רספטור לרטרו-ויראלי של עכברים, ולאחריה לנטי-ויראלי אקוטרופי.

איור 2. טרנסדוקציה בעילת נצח גבוהה של תאי אדם באמצעות לנטי-וירוס אקוטרופי המקודד ל-GFP. התאים עברו טרנסדוקציה מוקדמת עם Slc7a1, קולטן רטרו-וירוס עכברי. (A) שורת תאי רבדומיוסרקומה אנושית שנבחרו באמצעות בלאסטיצידין עבור Slc7a1 (Slc-hRMS), שעברו טרנסדוקציה (כחול) או שלא עברו טרנסדוקציה (ורוד) עם GFP. (B) מיקרוגרפ פלורסצנטי של Slc-hRMS שעברו טרנסדוקציה אקוטרופית (4X). (C) תאי HDFs שעברו טרנסדוקציה (כחול) וכאלו שלא עברו טרנסדוקציה (ורוד) עם לנטי-וירוס GFP אקוטרופי; התאים עברו טרנסדוקציה עם Slc7a1 יומיים לפני הטרנסדוקציה האקוטרופית. (D) תטר של לנטי-וירוס פסאודוטיפ VSV-G ולנטי-וירוס אקוטרופי, שנמדדו ב-Slc-hRMS.

איור 3. אופטימיזציה של ריכוזי כונדרויטין סולפט/פוליב rentable (CS/PB) בפיברובלסטים עוריים אנושיים. (A) חיוניות של HDFs שנמדדה באמצעות בדיקת MTT לאחר טרנסדוקציה בנוכחות PB בלבד או בריכוזים משתנים של CS/PB. (B) שיפור של יעילות הטרנסדוקציה ב-HDFs על ידי ריכוזים שונים של CS/PB, שנמדד באמצעות FACS. (C) כימות של שיפור הטרנסדוקציה, המראה כי טרנסדוקציה מקסימלית מתרחשת בריכוז של 100 μg/ml CS/PB.

איור 4. השפעת 400 μg/ml של CS/PB על טרנסדוקציה של Slc-hRMS באמצעות לנטיווירוס אקוטרופי. (A) שיפור בטיטר, ו-(B) שינוי בשגסוע (fold change) בקצב הטרנסדוקציה בהשוואה ל-6 μg/ml של polybrene לבדו.

איור 5. היעדר טרנסדוקציה אקוטרופית של HDFs בהיעדרו של הרצפטור Slc7a1 לרטרווירוס עכברי. (A) תרשים FACS של פיברובלסטים אנושיים BJ, ללא טרנסדוקציה (ורוד) או שעברו טרנסדוקציה (כחול) עם לנטיווירוס GFP אקוטרופי, בשני המקרים בהיעדרו של הרצפטור Slc7a1. פיברובלסטים אנושיים BJ שעברו טרנסדוקציה עם לנטיווירוס GFP אקוטרופי, ללא (B) ועם (C) טרנסדוקציה מוקדמת של הרצפטור Slc7a1 (4X).

דיון

רקומביננטי gammaretrovirus ecotropic מבוסס על וירוס Murine לוקמיה Moloney (MLV) ו mSlc7a1 הקולטן שלה נלמדים היטב הנפוצה, לאחר ששימש במשך 20 שנים כדי לספק transgenes לתאי Murine. Gammaretrovirus Ecotropic שימש גם ולאחרונה לספק אונקוגנים לתאי האדם;. בהקשר של תכנות מחדש הסלולר, השימוש mSlc7a1 להימנע דור של הנגיף amphotropic מחסה אונקוגנים האנושי מבוסס היטב ^4,5 עם זאת, lentivirus מספק יתרונות משמעותיים על פני gammaretrovirus ב transducing אוכלוסיות תאים עקשן, ⁶ תאים ראשוניים כולל שלעתים קרובות מטרות רצוי תכנות מחדש, משום מורכבות lentiviral מראש השילוב מאפשר התמרה של אי חלוקת התאים. ⁷

Lentiviruses הופקו עשרות pseudotypes שונים, לרבות MLV, בניסיון לשנות כמיהות וירוס, רעילות, ונכסים אחרים. ⁸ MLV-pseudotyped lentivirus ecotropic שימש transduce בתאי עכבר, ⁹ אך לעתים רחוקות נעשה שימוש על תאים אנושיים . ¹⁰ לפיכך, אנו מציעים את השימוש lentivirus MLV-pseudotyped ecotropic ככלי עלות בטוח, יעיל, היעילה ביותר, כדי לספק אונקוגנים ידועים או חשודים, כולל תכנות מחדש גורמים הסלולר, על תאים אנושיים.

זה קריטי לציין כי פרוטוקול זה לא לגמרי מבטל את הצורך לייצר ולהשתמש lentivirus pantropic, אלא פרוטוקול זה מפריד בין אונקוגן (ים) מן הנגיף pantropic, בידוד חוקרים פוטנציאל עצמית חיסון סרטן הקשורים וירוסים. MSlc7a1 חלבון hSlc7a1 homologue האנושי שלה באים לידי ביטוי בכל מקום בגוף מובילי חומצת אמינו עם tumorigenicity לא ידוע או היכולת להעניק יתרון צמיחה סלקטיבית על תאים הנמען, ¹¹ mSlc7a1 קבלת סיכון נמוך יחסית עבור הכללתו וירוס amphotropic. זהו צעד נוסף עשוי להיות שימושי במיוחד במעבדות חסר וירוס ייעודי או מתקני תרבות רקמות רמת biosafety הנדרש.

במצבים מסוימים זה עשוי להיות אפשרי כדי לבטל לחלוטין את השימוש וירוס pantropic ידי transfecting Slc7a1 הפלסמיד ישירות לתוך התאים היעד, אולם תאים רבים זה יהיה שימושי מטרות של טכניקה זו גם עקשן transfection. כחלופה, את היכולת לבודד Slc7a1-transduced תאים על ידי בחירת blasticidin כלומר VSV-G lentivirus pseudotyped ניתן להשתמש פעם אחת כדי ליצור מלאי של קולטן להביע תאים, לאחר וירוס ecotropic ניתן להשתמש באופן שגרתי transduce תאים אלו עבור רבים ניסויים. חוקרים צריך תמיד לעקוב אחר הנחיות הבטיחות המוסדי שלהם לעבודה עם lentivirus, ללא קשר כמיהות שלה.

Titers של הנגיף ecotropic שהושגו עם פרוטוקול זה בינוני נמוך יותר מאשר וירוס VSV-pseudotyped, בדרך כלל 10-20% של כייל הנגיף pantropic, בהסכם עם מחקרים קודמים. ⁹ titers אלה נמדדו בתאים אנושיים ביציבות transduced עם Slc7a1, כך נמוך יותר titer שנצפה עבור וירוס ecotropic יכול להיות גם בגלל ביטוי מגוון של הגן לקולטן בתאי המטרה. עם זאת, titers ויראלי להשיג בפרוטוקול שלנו הם יותר מהדרוש עבור מרבית היישומים להוביל התמרה של רוב התאים, במקרים מסוימים> 90% של תאים.

צנטריפוגה מבוססי טכניקות משמשות להתרכז חלקיקים נגיפיים. עם זאת, צנטריפוגה דורש מספר שעות, מייצר אירוסולים זיהומיות, והוא יכול לגרום לאובדן משמעותי של חלקיקים נגיפיים. ¹² כחלופה, complexation עם CS / PB יכול לשמש כדי לשפר התמרה מבלי לשנות כמיהות ויראלי. ³ שיטה זו היא מהירה (5 דקות ) וזול (0.03 דולר וירוס 10 מ"ל), בעוד בערך tripling titer ציין. אין ציוד מיוחד או חומרים כימיים קניינית נדרשים, ואנחנו נצפתה רעילות חריפה לאחר חשיפה מינימלית של HDFS ל CS / PB, בהסכם עם העבודה הקודמת שורות תאים אחרים. ¹³ חסרון אחד הפוטנציאל של פרוטוקול זה הוא חלק מתחמי לעין מיקרוסקופית פולימר לדבוק התאים במשך כמה ימים בתרבות. אנחנו לא יכולים לשלול את האפשרות כי קומפלקסים אלה, ואילו לא רעיל בגלוי על התאים, עלולות להיות השפעות עדינות יותר על תהליכים תאיים.

כאן יש לנו תיאר מתודולוגיה בבטחה וביעילות transducing תאים אנושיים עם גורמים בשעור. גישה זו צריכה להיות תועלת גדולה לחוקרים ללמוד אונקוגנים ו ביולוגיה של התא גזע כולל בתאי iPS.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	קולטן Murine MLV
pMD2.G	Addgene	12259	VSV-G המעטפה
pCMV-dR8.91	ד Trono מעבדה 14		אריזות פלסמיד (psPax2 פלסמיד המקבילה זמין Addgene, חתול. מספר 12260)
pHCMV-EcoEnv	Addgene	15802	Ecotropic המעטפה
FUGW	Addgene	14883	GFP פלסמיד מלאה
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	רוש	04 709 705 001
Hexadimethrine ברומיד (Polybrene)	סיגמא אולדריץ	H9268
נתרן כונדרויטין סולפט מלח סחוס כרישים	סיגמא אולדריץ	C4384
Blasticidin S	דיג	BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium ברומיד (MTT)	סיגמא אולדריץ	M2128
Igepal CA-630	סיגמא אולדריץ	I3021