מאמר שיטה

התמרה של תאים אנושיים עם Lentivirus פולימר-ומורכבת Ecotropic עבור Enhanced biosafety

17.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/2822

⸱

24 ביולי 2011

 , 
1Department of Cell Biology and Human Anatomy, School of Medicine, University of California, Davis

במאמר זה

סיכום

Lentiviruses הם כלי מחקר חשוב לחקר תפקוד הגנים, אולם החוקרים מומלץ להימנע הייצור של קידוד lentivirus pantropic ידוע או אונקוגנים חשד. כחלופה, אנו מציגים פרוטוקול בטוחה יותר לשימוש lentivirus ecotropic על תאים אנושיים שונה לבטא את mSlc7a1 קולטן ecotropic.

תקציר

גזע סרטניים ביולוגיה מחקרים תא לעיתים קרובות דורשים התמרה ויראלית של תאים אנושיים עם אונקוגנים ידועים או חשודים, העלאת בעיות בטיחות מרכזי אנשי המעבדה. Lentiviruses Pantropic, כגון נפוץ VSV-G pseudotype, הם כלי רב ערך ללימוד פונקציה גן משום שהם יכולים transduce סוגי תאים רבים, כולל תאים שאינם מתחלקים. עם זאת, החוקרים עשויים לרצות להימנע ייצור צנטריפוגה של וירוסים pantropic קידוד אונקוגנים עקב גבוה טיפול biosafety דרישות לרמה בעיות בטיחות. אונקוגנים מספר חזק, כולל c-myc ו SV40 אנטיגן T גדול, ידועים כדי לשפר את הייצור של המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSC). כל שאר ידוע iPSC וישכנע שינויים גנטיים (OCT4, Sox2, KLF4, Nanog, LIN28, ואובדן של תפקוד p53) יש גם קישורים סרטן, מה שהופך אותם דאגה בטיחות גבוהה יחסית גם כן.

בעוד אלה הקשורים לסרטן וירוסים מועילים ללמוד תכנות מחדש הסלולר pluripotency, יש להשתמש בהן בבטחה. כדי לטפל בבעיות אלה biosafety, אנחנו מדגימים שיטה התמרה של תאים אנושיים עם lentivirus ecotropic, עם דגש נוסף על עלות מופחתת וטיפול נוח. יש לנו המיוצר lentivirus ecotropic עם כייל גבוה מספיק כדי transduce יותר מ 90% של קולטן להביע תאים אנושיים שנחשפו לנגיף, תוקף את היעילות של גישה זו.

Lentivirus מרוכזת לעתים קרובות על ידי ultracentrifugation, אך תהליך זה לוקח כמה שעות יכול לייצר אירוסולים זיהומיות לחוקרים ביו האדם. כחלופה, חלקיקים נגיפיים יכול להיות משקעים בצורה בטוחה יותר על ידי תאים complexation עם סולפט כונדרואיטין ו polybrene (CS / PB). טכניקה זו מגבירה את titer ויראלי פונקציונלי עד פי 3 בתאים ביציבות לבטא קולטן רטרווירוס Murine, עם הזמן הוסיף העלות זניחה. התמרה של fibroblasts עורי האנושי (HDFS) היא משופרת מקסימאלי באמצעות CS / PB ריכוזים של פי כ -4 נמוך יותר משווי אופטימלי שדווח קודם לכן על שורות תאים סרטניים, טוען כי ריכוז הפולימר צריך להיות טיטרציה עבור סוג תא היעד של עניין. לפיכך, אנו מתארים את השימוש methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium ברומיד (MTT) כדי assay רעילות פולימר בסוג התא החדש. אנו צופים הכדאיות המקבילה של HDFS לאחר התמרה ויראלית או באמצעות complexation פולימר או את המינון הסטנדרטי של polybrene (PB, 6 מיקרוגרם / מ"ל), המעיד רעילות חריפה מינימלית.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש lentivirus ecotropic עבור overexpression של אונקוגנים בתאים אנושיים, הפחתת סיכונים biosafety והגדלת שיעור התמרה. אנחנו גם מדגימים את השימוש complexation פולימר כדי לשפר התמרה תוך הימנעות אירוסול יוצרי צנטריפוגה של חלקיקים נגיפיים.

פרוטוקול

1. ייצור, קציר והקפאה של לנטי-וירוס

  1. התייעצו עם קצין הבטיחות המוסדי שלכם לפני תחילת פרוטוקול זה, ופעלו לפי הנחיות הבטיחות המומלצות על ידו.
  2. יום 1. השתמשו בתאי 293T בריאים בעלי קצב גדילה מהיר להפקת הווירוס. זרעו את התאים בריכוז של 5 x 106 תאים לצלחת של 10 ס"מ. להפקת נגיפים יש להשתמש במצע 293T ללא אנטיביוטיקה (DMEM עם ריכוז גלוקוז גבוה, 10% FBS ו-4 mM L-glutamine).
  3. יום 2. בסוף אחר הצהריים, בצע טרנספקציה לתאי 293T באופן הבא (המספרים המצוינים הם עבור צלחת אחת של 10 ס"מ). המתן עד שכל הרכיבים יגיעו לטמפרטורת החדר. העבר בפיפט 375 μl OptiMEM לתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה, ולאחר מכן הוסף 25 μl Fugene HD. אין לאפשר ל-Fugene לא מדולל לבוא במגע עם פני השטח של המבחנה.
  4. במבחנת מיקרוצנטריפוגה, ערבב:
    • 5 μg פלסמיד העברה (Slc7a1, וקטור מטרה, או וקטור בקרה פלואורסצנטי)
    • 3.75 μg פלסמיד אריזה (pCMV-dR8.91 או psPax2)
    • 1.25 μg פלסמיד מעטפת (pMD2.G עבור פנטרופי, pHCMV-EcoEnv עבור אקוטרופי)
    • OptiMEM נטול סרום ל- 100 μl
  5. יש לשלב את שתי המבחנות ולהדגיר את התערובת למשך 20–30 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. החליפו את המצע בתאי ה-293T ל-10 מ"ל מצע 293T טרי ללא אנטיביוטיקה. הוסיפו את תערובת ה-Fugene/פלסמיד בטיפות לצלחת והדגרימו למשך הלילה ב- 37°C, 5% CO22.
  7. יום 3. החליפו את המצע של תאי ה-293T ל-10 מ"ל של מצע 293T טרי נטול אנטיביוטיקה. פעלו בעדינות, כיוון שתאי 293T נצמדים באופן רופף ועלולים להינתק אם המצע יופעל בפיפט בצורה חזקה מדי על השכבה החד-שכבתית (monolayer). הדגרירו במשך יומיים באינקובטור לח כדי לייצר את הווירוס.
  8. יום 5. קצור את הווירוס וסנן באמצעות מסנן 0.45 מיקרון בעל קישוריות חלבון נמוכה. השתמש באופן מיידי או חלק לאליקוטים לשימוש חד-פעמי והקפא ב-80°Cיש לבצע מדידה חוזרת של הטר (re-titer) עבור נגיפים פנטרופיים ואקוטרופיים קפואים לאחר אחסון של שישה חודשים וחודש אחד, בהתאמה.
  9. בצעו תיסור (Titer) של הווירוס באופן הבא, תוך שימוש בתאים הרגישים יחסית לטרנסדוקציה. טרנסדוקטיו את התאים עם וירוס בקרה פלואורסצנטי למשך לילה, תוך שימוש בדילוליות סדרתיות (למשל 1:10, 1:100, 1:1000) במצע טרי עם 6 μg/ml PB. למחרת, החליפו למצע רענן. המתינו יומיים לאחר ההעברה (transduction) עד שהתאים יתחילו לבטא את החלבון הפלואורסצנטי, ולאחר מכן קבעו את חלקם של התאים שהועברו באמצעות FACS. חשבו את הטיטר ביחידות טרנספורמציה (TU) למ"ל, בהתבסס על דילוולים שהניבו < 15% טרנסדוקציה כדי למזער אירועי טרנסדוקציה מרובים.
    נוסחת חישוב טיטר, משוואה לכמות נגיפים, ניתוח מתמטי בוירוסים.

2. טרנסדוקציה של תאי מטרה אנושיים באמצעות הקולטן הרטרו-ויראלי העכברי Slc7a1

  1. יש לבחור בריבוי זיהום (MOI) = 2 כדי להבטיח שרוב התאים יעברו טרנסדוקציה. עבור תאי מטרה העמידים לטרנסדוקציה, כגון HDFs, יידרש MOI גבוה יותר; במקרה זה, אנו מדוללים את העליון (supernatant) הוויראלי ביחס של 1:2 בלבד כדי להשיג טרנסדוקציה של מרבית התאים.
  2. יש לבצע טרנסדוקציה לתאי המטרה למשך לילה באמצעות העליון הוויראלי המדולל במצע גידול טרי עם 6 μg/ml PB, אשר מגביר את הטרנסדוקציה על ידי הגברת האינטראקציה האלקטרוסטטית בין הנגיף לתא המטרה.1 באופן אידיאלי, יש להשתמש בנפח מינימלי של נגיף, כגון 1 ml עבור צלחת של 35 mm, מכיוון שדיפוזיה היא גורם מגביל ביעילות הטרנסדוקציה.
  3. יש לגדל את התאים למשך 48 שעות לפחות לאחר הסרת הנגיף ולפני ביצוע טרנסדוקציה בנגיף אקוטרופי, וזאת כדי להבטיח ביטוי מספיק של הרצפטור Slc7a1.
  4. (אופציונלי) ניתן להשתמש בבלסטיסידין (blasticidin) כדי לבחור תאים שעברו טרנסדוקציה יציבה ומבטאים Slc7a1, במידת הצורך. יש להכין מראש עקומת הריגה של בלסטיסידין כדי לקבוע את הריכוז האפקטיבי הנמוך ביותר, בדרך כלל בין 2 – 10 μg/ml, ההורג את כל תאי המטרה שלא עברו טרנסדוקציה תוך 7 ימים. כיומיים לאחר הסרת נגיף ה-Slc7a1, יש להעביר את התאים שעברו טרנסדוקציה למצע המכיל בלסטיסידין. יש לגדל את התאים במצע המכיל בלסטיסידין למשך 7 ימים, שלב שבו כל התאים הנותרים יבטאו באופן יציב את הרצפטור הרטרווויראלי; בנקודה זו ניתן לבצע להם טרנסדוקציה בנגיף אקוטרופי וכן להקפיאם כמאגר לשימוש עתידי כשבץ תאים יציב המבטא Slc7a1.

3. טיטרציה של קומפלקס פולימר לקביעת רעילות

  1. יום 1. זריעת תאים בריכוז של 5000 cells/well בלוחית 96-בארים, תוך הקצאה של לפחות שלוש בארות חזרתיות (triplicate) לכל קבוצת ניסוי. יש לכלול תאים שלא עברו טרנסדוקציה במדיום מלא כדי לספק ערך בסיס לתאים בריאים, וכן דגימות של תאים במדיום נטול סרום להשראת עצירת גדילה כביקורת. במקביל, יש לזרוע תאים בפורמט מתאים (כגון לוחית 24-בארים) לצורך ניתוח מיקרוסקופי או ניתוח מבוסס FACS של יעילות הטרנסדוקציה בכל תנאי ניסוי.
  2. יום 2. ביצוע טרנסדוקציה לתאים בלוחיות שהוכנו הן עבור ניתוח MTT והן עבור ניתוח FACS באמצעות נגיף המקודד ל-GFP, ב-MOI של 0.5 כדי לבצע טרנסדוקציה ל-~40% מתאי המטרה. יש לבחון ריכוזים שונים של CS/PB (למשל 50, 100, 200, 400, 600, ו-800 mg/ml של כל רכיב), וכן 6 μg/ml PB, כדי לקבוע את הכמויות האופטימליות. יש להכין קומפלקסים פולימריים כפי שמתואר בחלק 4, להלן.
  3. יום 3. הסרת המדיום המכיל נגיף והחלפתו במדיום טרי. החזרת הלוחיות לאינקובטור לח.
  4. יום 5. ניתוח לוחית ה-FACS כדי לקבוע את יעילות הטרנסדוקציה עבור כל ריכוז פולימר.
  5. יום 6. הסרת המדיום מכל בארות לוחית ה-MTT והחלפתו ב-100 μl תמיסת MTT (ריכוז 1 mg/ml MTT במדיום מלא). דגירה למשך שלוש שעות באינקובטור לח כדי לאפשר את חיזור ה-MTT במיטוכונדריה של תאים פעילים מטבוליים.
  6. הסרת תמיסת ה-MTT והחלפתה ב-200 ml ממס MTT (ריכוז 0.1 N HCl, 0.1% Igepal CA-630 באיזופרופנול).
  7. דגירה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או עד שכל משקע ה-MTT formazan הסגול ימוס. קריאת הבליעה (absorbance) באמצעות קורא לוחות מיקרוסקופיות באורך גל של 570 nm, תוך חיסור קריאת הרקע ב-690 nm.
  8. בחירת ריכוז הפולימר האופטימלי המניב שיפור מקסימלי של הטרנסדוקציה, כפי שנקבע ב-FACS, עם השפעה מינימלית על הפעילות המטבולית, כפי שנקבע ב-MTT. עבור HDFs, בחרנו ב-100 μg/ml CS/PB בהתבסס על הנתונים המוצגים בתוצאות המייצגות (Representative Results), להלן.

4. טרנסדוקציה אקוטרופית באמצעות קומפלקסציה של פולימר

  1. הכינו תמיסות מא trữניות שעברו סינון סטרילי של PB וכונדרויטין סולפט בריכוז 20 mg/ml במים. חלקו לאליקווטים ואחסנו ב-20°C- .
  2. העבירו בפיפט את העליון (supernatant) הווירוסלי למבחנת מיקרוצנטריפוגה ודללו לריכוז הסופי הרצוי (למשל MOI של 2) באמצעות מצע תרבית טרי. הוסיפו בזה אחר זה נפחים שווים של PB וכונדרויטין סולפט (ריכוזים שנקבעו בשלב 3 לעיל), תוך써 נקישה של המבחנה לערבוב לאחר כל הוספה. התערובת הווירוסלית תהפוך לעכורה באופן מיידי עם היווצרות משקעים. דגרו את התערובת הווירוסלית בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כדי לאפשר היווצרות קומפלקסים.
  3. הסִירו את מצעי התרבית מהתאים המכוונים המבטאים את הרספטור, החליפו אותם בתערובת הווירוסלית, ודגרו למשך לילה ב-37°C, 5% CO2. לאחר הסרת התערובת הווירוסלית, שטפו את פני השטח של התאים פעמיים עם PBS כדי לסייע בהסרת הקומפלקסים הווירוסליים. הסרה מלאה אינה נחוצה; לא הבחנו בהשפעות שליליות על בריאות התאים כתוצאה מקומפלקסי פולימרים שאריות.

5. אימות הספציפיות של התעתוק האקוטרופי

  1. בעת הפקה ראשונה של וירוס אקוטרופי, מומלץ מנקודת מבט בטיחותית לוודא כי הווירוס אינו מסוגל לבצע טרנסדוקציה של תאי אדם שאינם שעברו שינוי. בצעו טרנסדוקציה לתאי אדם עם לנטיווירוס אקוטרופי בריכוז גבוה יחסית (דילול של פי 1 עד 2 בלבד של תגית הווירוס במצע טרי) למשך לילה, עם 6 μg/ml PB או ריכוז מותאם של CS/PB.
  2. הסירו את המצע המכיל את הווירוס והחליפו אותו במצע טרי. לאחר דגירה של התאים למשך יומיים, אששו את ביטוי הגן המועבר באמצעות FACS בעזרת וקטורים פלואורסצנטיים ו/או באמצעות RT-PCR עם פריימרים ספציפיים לגן המועבר.

6. תוצאות מייצגות:

איור 1A מציג את תהליך ייצור הלנטי-וירוס, ואיור 1B מציג טרנסדוקציה של תאי אדם עם לנטי-וירוס אקוטרופי, כולל טרנסדוקציה מקדימה עם הרצפטור למוראני רטרווירוס Slc7a1. לצורך תיתור הוירוס, אנו משתמשים בשורת תאי רבדומיוסרקוממה של אדם שעברו טרנסדוקציה יציבה של Slc7a1 (Slc-hRMS). בעת שימוש בווקטורי בקרה פלואורסצנטיים לניטור יעילות הטרנסדוקציה, אנו משיגים באופן שגרתי יעילות טרנסדוקציה של > 90% של Slc-hRMS עם וירוס אקוטרופי, כפי שמוצג באיורים 2A ו-2B. שיעורי הטרנסדוקציה של HDFs הם בדרך כלל נמוכים יותר מכיוון שהתאים לא עברו סלקציה באמצעות בלאסטיצידין לביטוי הרצפטור (איור 2C). התיתורים של לנטי-וירוס אקוטרופי הם בדרך כלל 10-20% מהוירוס הפסאודו-טיפי ל-VSV כאשר הם נמדדים ב-Slc-hRMS (איור 2D).

מחזור אחד של הקפאה-הפשרה מפחית את התיתר (titer) של נגיף אקוטרופי ב-3% - 16%, ערך השווה לאובדן התיתר במהלך מחזור הקפאה-הפשרה בודד של נגיף עם פסאודו-טיפ של VSV (p > 0.05). בניגוד לדיווחים קודמים,2 לא הבחנו בהשפעה חיובית על תיתר הנגיף כתוצאה מהקפאה מהירה (flash freezing) בקרח יבש. במקום זאת, השגנו תיתרים גבוהים יותר לאחר הפשרה עבור שני סוגי הפסאודו-טיפים פשוט על ידי הנחת מבחנות הנגיף במקפיא של -80°C (נתונים לא מוצגים).

בדיקת חיוניות MTT מאפשרת זיהוי רגיש של עצירה בצמיחה בתאי מטרה. טרנסדוקציה באמצעות נגיף בתוספת ריכוזים של CS/PB עד 800 μg/ml אינה משפיעה על מטבוליזם של HDF (איור 3A). חשיפה ל-CS/PB ללא נגיף אינה גורמת גם היא להשפעה רעילה על התאים (נתונים לא מוצגים). ניתוח FACS של תאי HDF שעברו טרנסדוקציה עם נגיף בתוספת ריכוזים שונים של CS/PB מראה שיפור בטרנסדוקציה בהשוואה ל-PB לבדו (איור 3B). השיפור המקסימלי מתרחש בריכוז של 100 μg/ml של CS/PB (איור 3C), נתון הנמוך פי כמה מערכים שדווחו בעבר.3 לכן, חשוב לבצע אופטימיזציה של התנאים עבור כל סוג תא מטרה נתון.

קומפלקסציה עם CS/PB מגבירה את התיתר שנצפה פי 3 בקירוב ב-Slc-hRMS (איור 4A, p < 0.01). בפועל, הדבר מניב השפעה גדולה יותר על יעילות הטרנסדוקציה בריכוזי וירוס נמוכים מאשר בריכוזים גבוהים יותר (איור 4B), מה שכנראה נובע מתאים שעברו טרנסדוקציה מרובה ומרוויית רצפטורים בריכוזי וירוס גבוהים יותר.

טרנסדוקציה באמצעות וירוס אקוטרופי (ecotropic virus) היא ספציפית לתאים המבטאים רצפטור לרטרווירוס של עכברים. בעת ביצוע טרנסדוקציה לתאים אנושיים לא מעובדים באמצעות וירוס אקוטרופי, לא צפינו בفلורסצנציה הגבוהה מהרקע של תאים שאינם שעברו טרנסדוקציה, בין אם נעשה שימוש ב-PB או ב-CS/PB, כפי שמוצג באיור 5A. בבחינה מיקרוסקופית, HDFs אינם מראים טרנסדוקציה בהיעד רצפטור (איור 5B), בעוד שטרנסדוקציה מוקדמת של הרצפטור מובילה לתאים פלואורסצנטיים (איור 5C).

תרשים תהליך ייצור לנטיווירוס, המציג את שלבי התעתוק של תאי 293T ואת העל-נוזל הויראלי.
איור 1. מבט סכמטי של (A) תהליך ייצור הווירוס ו-(B) תעתוק של תאי אדם עם רספטור לרטרווירוס עכברי, ולאחריו לנטיווירוס אקוטרופי.

גרפים של ציטומטריה של זרימה, ניתוח אחוז תאי GFP+, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, תרשים עמודות של טיטר וירוס.
איור 2. טרנסדוקציה ביעילות גבוהה של תאי אדם באמצעות לנטי-וירוס אקוטרופי המקודד ל-GFP. התאים עברו טרנסדוקציה מוקדמת עם Slc7a1, רספטור לרטרו-וירוס של עכברים. (A) שורת תאי רבדומיוסרקומה של אדם שנבחרו באמצעות בלאסטיצידין עבור Slc7a1 (Slc-hRMS), שעברו טרנסדוקציה (כחול) או שלא עברו טרנסדוקציה (ורוד) עם GFP. (B) מיקרוגרף פלואורסצנטי של תאי Slc-hRMS שעברו טרנסדוקציה אקוטרופית (4X). (C) תאי HDFs שעברו טרנסדוקציה (כחול) ואלו שלא עברו טרנסדוקציה (ורוד) עם לנטי-וירוס GFP אקוטרופי; התאים עברו טרנסדוקציה עם Slc7a1 יומיים לפני הטרנסדוקציה האקוטרופית. (D) טיטר של לנטי-וירוס פסאודוטיפי VSV-G ואקוטרופי, שנמדד בתאי Slc-hRMS.

השפעות ריכוז הפולימר על ביטוי GFP; גרפים של בליעה, ציטומטריית זרימה ו-GFP%.
איור 3. אופטימיזציה של ריכוזי chondroitin sulfate/polybrene (CS/PB) בפיברובלסטים דרמליים אנושיים. (A) חיוניות של HDFs שנמדדה באמצעות מבחן MTT לאחר טרנסדוקציה בנוכחות PB בלבד או בריכוזים משתנים של CS/PB. (B) שיפור של יעילות הטרנסדוקציה ב-HDFs על ידי ריכוזים שונים של CS/PB, כפי שנמדד ב-FACS. (C) כימות של שיפור הטרנסדוקציה, המראה כי טרנסדוקציה מקסימלית מתרחשת בריכוז של 100 μg/ml CS/PB.

ניתוח יעילות טרנסדוקציית גנים לעומת טיטר, תרשים עמודות וגרף פיזור, השוואת השפעת פוליברן.
איור 4. השפעת 400 μg/ml CS/PB על טרנסדוקציה של Slc-hRMS באמצעות לנטי-וירוס אקוטרופי. (A) הגברת הטיטר, ו-(B) שינוי שכיח (fold change) בקצב הטרנסדוקציה בהשוואה ל-6 μg/ml פוליברן לבדו.

גרף עצימות GFP בציטומטריית זרימה עם תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית המראות את התפלגות תאי GFP+.
איור 5. היעדר טרנסדוקציה אקוטרופית של HDFs בהיעדרו של הקולטן למרטרווירוס של עכברים Slc7a1. (A) תרשים FACS של פיברובלסטים אנושיים BJ, לא שעברו טרנסדוקציה (ורוד) או שעברו טרנסדוקציה (כחול) עם לנטי-וירוס GFP אקוטרופי, בשני המקרים בהיעדרו של הקולטן Slc7a1. פיברובלסטים אנושיים BJ שעברו טרנסדוקציה עם לנטי-וירוס GFP אקוטרופי, ללא (B) ועם (C) טרנסדוקציה מקדימה של הקולטן Slc7a1 (4X).

דיון

רקומביננטי gammaretrovirus ecotropic מבוסס על וירוס Murine לוקמיה Moloney (MLV) ו mSlc7a1 הקולטן שלה נלמדים היטב הנפוצה, לאחר ששימש במשך 20 שנים כדי לספק transgenes לתאי Murine. Gammaretrovirus Ecotropic שימש גם ולאחרונה לספק אונקוגנים לתאי האדם;. בהקשר של תכנות מחדש הסלולר, השימוש mSlc7a1 להימנע דור של הנגיף amphotropic מחסה אונקוגנים האנושי מבוסס היטב 4,5 עם זאת, lentivirus מספק יתרונות משמעותיים על פני gammaretrovirus ב transducing אוכלוסיות תאים עקשן, 6 תאים ראשוניים כולל שלעתים קרובות מטרות רצוי תכנות מחדש, משום מורכבות lentiviral מראש השילוב מאפשר התמרה של אי חלוקת התאים. 7

Lentiviruses הופקו עשרות pseudotypes שונים, לרבות MLV, בניסיון לשנות כמיהות וירוס, רעילות, ונכסים אחרים. 8 MLV-pseudotyped lentivirus ecotropic שימש transduce בתאי עכבר, 9 אך לעתים רחוקות נעשה שימוש על תאים אנושיים . 10 לפיכך, אנו מציעים את השימוש lentivirus MLV-pseudotyped ecotropic ככלי עלות בטוח, יעיל, היעילה ביותר, כדי לספק אונקוגנים ידועים או חשודים, כולל תכנות מחדש גורמים הסלולר, על תאים אנושיים.

זה קריטי לציין כי פרוטוקול זה לא לגמרי מבטל את הצורך לייצר ולהשתמש lentivirus pantropic, אלא פרוטוקול זה מפריד בין אונקוגן (ים) מן הנגיף pantropic, בידוד חוקרים פוטנציאל עצמית חיסון סרטן הקשורים וירוסים. MSlc7a1 חלבון hSlc7a1 homologue האנושי שלה באים לידי ביטוי בכל מקום בגוף מובילי חומצת אמינו עם tumorigenicity לא ידוע או היכולת להעניק יתרון צמיחה סלקטיבית על תאים הנמען, 11 mSlc7a1 קבלת סיכון נמוך יחסית עבור הכללתו וירוס amphotropic. זהו צעד נוסף עשוי להיות שימושי במיוחד במעבדות חסר וירוס ייעודי או מתקני תרבות רקמות רמת biosafety הנדרש.

במצבים מסוימים זה עשוי להיות אפשרי כדי לבטל לחלוטין את השימוש וירוס pantropic ידי transfecting Slc7a1 הפלסמיד ישירות לתוך התאים היעד, אולם תאים רבים זה יהיה שימושי מטרות של טכניקה זו גם עקשן transfection. כחלופה, את היכולת לבודד Slc7a1-transduced תאים על ידי בחירת blasticidin כלומר VSV-G lentivirus pseudotyped ניתן להשתמש פעם אחת כדי ליצור מלאי של קולטן להביע תאים, לאחר וירוס ecotropic ניתן להשתמש באופן שגרתי transduce תאים אלו עבור רבים ניסויים. חוקרים צריך תמיד לעקוב אחר הנחיות הבטיחות המוסדי שלהם לעבודה עם lentivirus, ללא קשר כמיהות שלה.

Titers של הנגיף ecotropic שהושגו עם פרוטוקול זה בינוני נמוך יותר מאשר וירוס VSV-pseudotyped, בדרך כלל 10-20% של כייל הנגיף pantropic, בהסכם עם מחקרים קודמים. 9 titers אלה נמדדו בתאים אנושיים ביציבות transduced עם Slc7a1, כך נמוך יותר titer שנצפה עבור וירוס ecotropic יכול להיות גם בגלל ביטוי מגוון של הגן לקולטן בתאי המטרה. עם זאת, titers ויראלי להשיג בפרוטוקול שלנו הם יותר מהדרוש עבור מרבית היישומים להוביל התמרה של רוב התאים, במקרים מסוימים> 90% של תאים.

צנטריפוגה מבוססי טכניקות משמשות להתרכז חלקיקים נגיפיים. עם זאת, צנטריפוגה דורש מספר שעות, מייצר אירוסולים זיהומיות, והוא יכול לגרום לאובדן משמעותי של חלקיקים נגיפיים. 12 כחלופה, complexation עם CS / PB יכול לשמש כדי לשפר התמרה מבלי לשנות כמיהות ויראלי. 3 שיטה זו היא מהירה (5 דקות ) וזול (0.03 דולר וירוס 10 מ"ל), בעוד בערך tripling titer ציין. אין ציוד מיוחד או חומרים כימיים קניינית נדרשים, ואנחנו נצפתה רעילות חריפה לאחר חשיפה מינימלית של HDFS ל CS / PB, בהסכם עם העבודה הקודמת שורות תאים אחרים. 13 חסרון אחד הפוטנציאל של פרוטוקול זה הוא חלק מתחמי לעין מיקרוסקופית פולימר לדבוק התאים במשך כמה ימים בתרבות. אנחנו לא יכולים לשלול את האפשרות כי קומפלקסים אלה, ואילו לא רעיל בגלוי על התאים, עלולות להיות השפעות עדינות יותר על תהליכים תאיים.

כאן יש לנו תיאר מתודולוגיה בבטחה וביעילות transducing תאים אנושיים עם גורמים בשעור. גישה זו צריכה להיות תועלת גדולה לחוקרים ללמוד אונקוגנים ו ביולוגיה של התא גזע כולל בתאי iPS.

גילויים

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

המימון לפרויקט זה סופק על ידי מכון קליפורניה עבור רפואה רגנרטיבית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב חברה מספר קטלוגי תגובות
pLenti6/UbC/mSlc7a1 Addgene 17224 קולטן Murine MLV
pMD2.G Addgene 12259 VSV-G המעטפה
pCMV-dR8.91 ד Trono מעבדה 14 אריזות פלסמיד (psPax2 פלסמיד המקבילה זמין Addgene, חתול. מספר 12260)
pHCMV-EcoEnv Addgene 15802 Ecotropic המעטפה
FUGW Addgene 14883 GFP פלסמיד מלאה
OptiMEM Invitrogen 31985
Fugene HD רוש 04 709 705 001
Hexadimethrine ברומיד (Polybrene) סיגמא אולדריץ H9268
נתרן כונדרויטין סולפט מלח סחוס כרישים סיגמא אולדריץ C4384
Blasticidin S דיג BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium ברומיד (MTT) סיגמא אולדריץ M2128
Igepal CA-630 סיגמא אולדריץ I3021

מקורות

  1. Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation. Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).
  2. Marino, M. P., Luce, M. J., Reiser, J. Small- to large-scale production of lentivirus vectors. Methods Mol Biol. 229, 43-55 (2003).
  3. Landazuri, N., LeDoux, J. M. Complexation of retroviruses with charged polymers enhances gene transfer by increasing the rate that viruses are delivered to cells. J Gene Med. 6, 1304-1319 (2004).
  4. Ohnuki, M., Takahashi, K., Yamanaka, S. Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 4, 4A.2-4A.2 (2009).
  5. Hotta, A. EOS lentiviral vector selection system for human induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 4, 1828-1844 (2009).
  6. Reiser, J. Transduction of nondividing cells using pseudotyped defective high-titer HIV type 1 particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 15266-15271 (1996).
  7. Cullen, B. R. Journey to the center of the cell. Cell. 105, 697-700 (2001).
  8. Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Curr Gene Ther. 5, 387-398 (2005).
  9. Schambach, A. Lentiviral vectors pseudotyped with murine ecotropic envelope: increased biosafety and convenience in preclinical research. Exp Hematol. 34, 588-592 (2006).
  10. Koch, P., Siemen, H., Biegler, A., Itskovitz-Eldor, J., Brustle, O. Transduction of human embryonic stem cells by ecotropic retroviral vectors. Nucleic Acids Res. 34, e120-e120 (2006).
  11. Yoshimoto, T., Yoshimoto, E., Meruelo, D. Molecular cloning and characterization of a novel human gene homologous to the murine ecotropic retroviral receptor. Virology. 185, 10-17 (1991).
  12. Cepko, C. Large-scale preparation and concentration of retrovirus stocks. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.12-Unit 9.12 (2001).
  13. Doux, J. M. L. e, Landazuri, N., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Complexation of retrovirus with cationic and anionic polymers increases the efficiency of gene transfer. Hum Gene Ther. 12, 1611-1621 (2001).
  14. Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol. 72, 9873-9880 (1998).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MTTFACS
התמרה של תאים אנושיים עם Lentivirus פולימר-ומורכבת Ecotropic עבור Enhanced biosafety
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.