הקרנת Assay עבור סטרס חמצוני בתוך הקו Cell חתולים Astrocyte, G355-5

סיכום

שיטת ההקרנה לזהות סביבות הסלולר חמצוני היא למדוד את החמצון של CM-H2DCFDA. לאחר חמצון מן הלא למתחם ניאון ניאון בתוך, תא CM-H2DCFDA שינויים. שינוי זה של הקרינה נמדדת cytometry זרימה ומציין את מספר התאים בסביבה חמצוני.

תקציר

לעתים קרובות, הציע מנגנון של וירוס המושרה נזק עצבי הוא סטרס חמצוני. האסטרוציטים יש תפקיד חשוב בשליטה על סטרס חמצוני של מערכת העצבים המרכזית (CNS). האסטרוציטים לעזור לשמור על הסביבה homeostatic עבור נוירונים, כמו גם נוירונים להגנה מפני מינים החמצן מגיב (ROS). CM-H2DCFDA הוא אינדיקטור התא חדיר עבור נוכחות של ROS. CM-H ₂ DCFDA נכנס לתא כמתחם לא ניאון, ואז הוא הופך ניאון לאחר esterases הסלולר להסיר את קבוצות אצטט, ואת מתחם מתחמצן. מספר תאים, נמדד על ידי cytometry זרימה, כי הם מצאו להיות fluorescing ירוק הוא אינדיקציה למספר התאים נמצאים במצב חמצוני. CM-H ₂ DCFDA רגיש חמצון על ידי מספר גדול של ROS שונים. חוסר הספציפיות, שלגביו ROS יכול לחמצן CM-H ₂ DCFDA, עושה את זה תרכובת עוצר ערך לשימוש בשלבים הראשונים של חקירת הפתוגנזה, כמו זו assay יכול לשמש מסך עבור הסביבה הסלולרית חמצוני ללא תלות חמצן רדיקלי או שילוב של ROS אחראים התנאים הסלולר. ברגע שזה נקבע כי ROS נוכחים ידי חמצון של CM-H ₂ DCFDA, אז ניסויים נוספים ניתן לבצע כדי לקבוע אילו ROS או שילוב של רוס מעורבים בתהליך הפתוגנזה בפרט. תוצאות המחקר הזה מראים כי עם תוספת של חמצן עלייה CM-H ₂ DCFDA לזרוח זוהה יחסית שולטת מלוחים, המציין כי assay זה מבחן חשוב לאיתור סביבה חמצוני בתוך G355-5 תאים, חתולים תא astrocyte קו.

פרוטוקול

1. Cell תרבות של האסטרוציטים חתולים ולטיפול עם H ₂ O ₂

1. תא התרבות קו G355-5 ב בקבוקון 75 ס"מ ² עם התקשורת DMEM בתוספת חומרים מזינים ב 37 ° C ו 5% CO ₂ ומחוברות עד 60% (~ 5 ימים). החלף את המדיה כל 1-2 ימים או לפי הצורך לשמור על תרבות בריאה.
2. הסר מדיה להוסיף 2 מ"ל של טריפסין 0.25%. הרם את התאים על ידי pipetting עבור 45 שניות - 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
3. העבר במהירות את ההשעיה על צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של התקשורת. מערבבים בעדינות.
4. צנטריפוגה XG ב 300, 23 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות כדי לקבל גלולה. בטל supernatant מבלי להפריע גלולה.
5. הוסף 6-7 מ"ל של התקשורת טריים resuspend התאים.
6. הוסף את ~ 1 מ"ל של התאים היטב בכל צלחת 6 באר. הוסף 2-3 מ"ל של התקשורת זה טוב לדגור עד ומחוברות 80-90%.
7. הכן פתרון 100μM של מי חמצן (H ₂ O ₂₎ בתקשורת.
8. הסר מדיה מכל טוב ולהחליף או 2 מ"ל התקשורת טרי (שליטה), 2 מ"ל של H ₂ O ₂ (טיפול) או 2ml של DPBS. לדגור על 37 ° C CO, 5% ₂ עבור 3 ח
9. הסר פתרונות ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין להרים את התאים. העברת התאים צינור 1.7 Eppendorf מ"ל מכיל 0.5 DPBS מ"ל. צעד זה צריך להתבצע על כל אחד בנפרד גם כדי למנוע מוות של תאים מן טריפסין דגירה ממושכת.
10. ספין על XG 300 דקות 3, לבטל את supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל של DPBS.

2. מכתים עבור ROS

1. צעדים עבור כל מכתים צריך להתבצע עם חשיפה לאור מינימלי כדי למנוע הלבנת.
2. הוסף 1 μl של CCCP 50 מ"מ לשלוט חיובית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ דקות 5.
3. הוסף 5 μl של 10 CM-H פתרון mM DCFDA ₂ לקבוצה ₂ H ₂ O. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ דקות 15-30. כתם לא מתווסף המדגם מלוחים.
4. לשטוף דגימות עם 2 מ"ל של DPBS להסיר כתם שיורי.
5. ספין על XG 300 דקות 3 כדי לקבל גלולה.
6. Resuspend תאים 0.5 מ"ל של DPBS. הוסף 1 μl PI לטעום כל, למעט מלח.
7. העברת דגימות צינור הזרימה 5 מ"ל cytometer.
8. הפעלה על cytometer את הזרימה.

3. תזרים cytometry

1. הפעל דגימות על Beckman Coulter FC500 (או שווה ערך) מצויד 488 ננומטר ארגון לייזר עובר הלהקה הבאה: 525, 775 ו - 620 ננומטר, כל ± 20 ננומטר.
2. הכן את שולטת המתאים: תאים בלא כתם, מוכתם CM-H ₂ DCFDA בלבד, רק PI, מוכתם כפול (בקרה שלילית).
3. הפוך את פרוטוקול יש histoplots הבאים: FS מול אס, לצרכן לעומת CM-H ₂ DCFDA. זה צריך גם את היסטוגרמות הבאים: מספר התא לעומת FL1, fl2 ו FL3, התואמת את הכתמים.
4. לפני הפעלת דגימות, לבדוק, ציוד נוזלים מיכל פסולת. לחמם את ציוד דקות לפחות 20.
5. נקו את הציוד לבצע כיול עם חרוזים המתאים על פי הסטנדרטים היצרנים.
6. בחר פרוטוקול שלכם ולהפעיל את הדגימות.
7. נקו את הציוד כפי שנעשה בעבר.
8. נקו את קו ואקום פי הסטנדרטים היצרנים.
9. כבה את זרימת ולנקות את קו הראש / ואקום.
10. כבה את התוכנה ואת המחשב.

4. נציג תוצאות:

Cytometry תוצאות תזרים נותחו באמצעות FlowJo 7.6 ואת שולטת כתם שימשו אובייקטיבית להגדיר את gating. על בסיס זה, תאים בריאים להופיע בצד שמאל של ההיסטוגרמה ו ROS (סטרס חמצוני) זוהה כמו שינוי של תאים ימינה. איור 1 מציג את תוצאות ההשפעה של חמצן על האסטרוציטים חתולים בריאים. מנתוני FL1 שימש למדוד את העוצמה של CM-H ₂ DCFDA, אשר מעיד על קיומו של ROS. כצפוי, כמות גבוהה יותר של ROS זוהה במדגם שטופלו H ₂ O _2. זה מוצג על ההיסטוגרמה כמו שינוי בעוצמת פלורסנט משמאל לימין. כאשר משווים תאים בריאים שטופלו DMEM לעומת DPBS, לא חל שינוי משמעותי בהיקף של ROS (איור 2).

1. תרשים זרימה cytometry תוצאות של רמות של סטרס חמצוני של האסטרוציטים חתולים בריאים ההשפעה של H ₂ O ₂ על תאים בריאים. תוצאות המחקר מראות כי H ₂ O ₂ מעלה את רמות של ROS בתאים בריאים לעומת תאים ללא טיפול (DMEM).

2. תרשים זרימה cytometry תוצאות הרמות של ROS שהתגלו תאים בריאים מודגרות עבור 3hrs עם DPBS.

דיון

המנגנון המוצע לעתים קרובות של הנגיף המושרה נזק עצבי הוא סטרס חמצוני ^{1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31.} בעיקרון, מוצע כי באמצעות חשיפה ויראלי גליה (האסטרוציטים ו microglia) לשחרר רדיקלים תגובתי כגון, הידרוקסיד, אניון superoxide, תחמוצת החנקן, ו / או מי חמצן, שהם רעילים לנוירונים. באופן דומה, סטרס חמצוני יש גם הציע כמנגנון פתולוגיים מרכזי מתאמפטמין-Induced neurotoxicity ^{2, 6, 17.} מאז הקבוצה מעוניינת את השפעת הווירוס וגם סמים של התעללות על מערכת העצבים המרכז...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
DMEM	Cellgro	15-013-CV
ממ ויטמינים	Cellgro	25-020-CL	1% (V / V)
L-גלוטמין	Hyclone	17-605E	1% (V / V)
ללא חומצות אמינו חיוניות	Hyclone	25-025-CL	1% (V / V)
FBS	Hyclone	SH30071.03	20% (V / V)
חומצות אמינו חיוניות	Cellgro	25-030-CL	0.2% (V / V)
מערכת סינון אבק 500ml	VWR	87006-076
15 צינורות חרוטי מ"ל	בז	352097
75 2 ס"מ בתרבית רקמה צלוחיות	בז	353136
6 רקמה היטב בתרבות צלחת	בז	353224
CM-H 2 DCFDA	Invitrogen	C6827
Propidium יודיד (PI)	סיגמא	P4170-10 מ"ג
טריפסין	Lonza	17-160F
H 2 O 2	סיגמא	H6520
HyQ לאנטיביוטיקה	Hyclone	SV30079.01	0.1% (V / V)
G355-5 תאים	ATCC	CRL-2033	המוח החתולי רגיל