$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הקמה
- הגדרת אזור כירורגית כפי שמוצג באיור. 1 א ', א'. רכיבי מפתח של הגדרת לכלול Femtojet Eppendorf microinjector, micromanipulator Narishige עם בעל מחט, steromicroscope לייקה, מערכת סיבים אופטיים תאורה, ECM 830 Wave כיכר electroporation מערכת עם אלקטרודות, כרית חימום ו מאדה עבור הרדמה isoflurane.
- יש לנקות את כל הכלים עם שואב Ultrasonic Bransonic באמצעות Metriclean2 פתרון הקצפה נמוכה עבור sonicating כלים כירורגיים. לעקר כלים ידי מעוקר. כלי מעוקר נשמרים אז Germex.
- הכן מזרקים סטריליים עם מלח חמים סטרילי פתרון Lactated רינגר.
2. הרדמה
- מקום חיה בתוך קטן (12cm x 20 ס"מ) הרדמה קאמרית. שימוש מאדה, לספק הרדמה isoflurane 5% חמצן 1L/min (איור 1 א ', א'). יש לציין, חשוב לאסוף למצות isoflurane באמצעות מערכת הדחה.
- הסר חיה מן החדר כאשר הנשימה הופכת להיות עמוקה וסדירה. צובט הבוהן כהרף עין בדיקות רפלקס משמשים כדי להבטיח הרדמה מלאה.
- המקום העכבר בהריון על גבו על גבי כרית חימום (37 מעלות צלזיוס). כרית חימום מעוקר לראשונה על ידי מנגב עם אתנול 70%, והוא מכוסה אז עם כרית, מעוקרים גזה lintless. השתמש צינור ההנשמה ומכשירים מסכה לספק isoflurane (2.25%) במהלך הניתוח.
- הזרק עצירות (משקל הגוף 0.1mg/kg) תת עורי מתחת לעור בבית בעורף.
- צג בעל חיים ברחבי ניתוח נשימה עמוקה קבוע. חיים לא צריך התנשמות, נשום עמוק או במהירות. נשימה שטחית, מהירה עשוי להיות סימן של אור הרדמה, ואת זרימת isoflurane צריכה להיות מוגברת. אם החיה מתחילה להשתנק, להפחית את זרימת isoflurane. במקרה של דום נשימה, לכבות isoflurane, ולהגביר את זרימת החמצן עד חיה משחזרת. הפעל מחדש isoflurane בריכוז נמוך.
3. בעלי חיים כהכנה לניתוח
- Tape forelimbs של חיה לרפד את החימום לבדוק שוב בתגובה הכחשה על ידי צובט את הרגל האחורית עם מלקחיים בוטה.
- באמצעות ספוגית כותנה שקצהו סטרילי, להפיץ שכבה עבה של קרם מקריח (כלומר, Nair) על הבטן. ב שבץ המשרד, להבטיח את underfur מצופה לחלוטין. השאר על ממוצע של שלוש דקות, בודקים לסירוגין עם ספוגית נקייה סטרילית להסרת שיער. רטוב תחבושת סטרילית עם מים סטריליים ולנגב את הבטן עד שכל העקבות נעלמו. חזור עם chlorhexidine (כלומר, Stanhexidine) עור נקי יותר מים. יבש את הבטן עם גזה נקי סטרילי.
- לעקר אתר חתך עם chlorhexidine (כלומר, Stanhexidine) ואחריו מים סטריליים יותר. יבש את הבטן עם גזה נקי סטרילי. חזור על שלב זה באמצעות אתנול 70% ו ספוגית טרי, כותנה מעוקרים.
- הנח תחבושת סטרילית על הבטן עם חריץ באמצע שדרכם הקרניים הרחם ימשך במהלך הניתוח.
4. החתך חשיפה של קרני הרחם
- כדי לחשוף את קרני הרחם, תחילה לאתר את linea alba כקו חלש מתחת לעור על קו האמצע. בעזרת מלקחיים, למשוך את העור מהקיר בטן לחתוך חתך קטן, ישר מאמצע הבטן כלפי מטה במספריים העור (כ 1 ס"מ אורך).
- בעזרת מלקחיים ומספריים מעוקל, לחזור על התהליך עם הצפק.
- המקום גזה סטרילי עם חריץ אנכי קטן על החתך ו לצנן עם מלח סטרילית חימם.
- Slide מלקחיים לתוך החתך ולאתר את הרחם. החזק חתך פתוח עם מלקחיים תוך הסרת קרניים הרחם.
- בזהירות לתפוס את הרחם בין עוברים לעין הראשונה והשנייה למשוך את העוברים על גבי גזה. הסר את שני הצדדים של קרניים הרחם, הצבת על גבי גזה סטרילית לספור את מספר העוברים, וציין כל resorptions או "לא בריא" (למשל גודל גוף קטן יותר) עוברים. רטוב בקרנות הרחם עם מלח בזהירות להחזיר מחצית הרחם לתוך הבטן.
5. הזרקה של ה-DNA לתוך החדרים
- מחטים כירורגי מוכנים עם פולר Flaming micropipette סאטר באמצעות micropipettes בורוסיליקט עם נימים (תוכנית: חום = 750, משוך = 30, לוול ךיב = 90, זמן = 150). באמצעות להב אזמל סטרילי, קצה מחט הוא גילח בעדינות בזווית של 45 מעלות.
- כדי לטעון את המחט, טפטפות פסטר נמשכים עד קוטר צר תחת אש. חתיכת פה מחוברת פיפטה הטעינה להכין ~ 10 μl של ה-DNA רעלן פנימי ללא 3mg/ml מעורבב עם 0.01% מתיל ירוק (הערה: מתיל ירוק צבע מאפשר זריקות DNA להיות דמיינו). המחט מלא מותקן אז על דוכן micromanipulator ו מצורף מזרק Femtojet.
- החל העובר הקרובים השחלה, מלקחיים מעגליתמשמשים כדי להפוך בעדינות את העובר בתוך decidua כך שהוא ממוקם "עם הפנים קדימה", המאפשר זריקות להתרחש מקורי לכיוון הזנב. מקור סיבים אופטיים אור לתאורה משמש כדי לסייע לדמיין את קו האמצע של המוח העוברי, אשר מוקף החדרים לרוחב גדול באזורים מקורי (איור 1 ב ', ב').
- העובר הוא החזיק בעמדה באמצעות מלקחיים מעגלית. המחט ממוקם מעל הרחם כך את זווית הכניסה לתוך המוח הוא כ 45 מעלות. שימוש micromanipulator, לבין תנועה מהירה ויציבה, קצה המחט מוחדרת דרך דופן הרחם לתוך החדר הלטרלי של העובר. זריקות מכוונים לרוחב החדרים, החדר 3 או רווח subretinal ליעד, telencephalon diencephalon ואת הרשתית, בהתאמה. שים לב שלפוחית המוח העוברי פתוחים בשלבים עובריים מוקדם כזה DNA שהוחדר לתוך החדרים לרוחב יזרמו אל החדר 3 rd.
- לחצו על הדוושה ברגל כדי להזריק רעלן פנימי ללא ה-DNA (1-3 μL) באמצעות Femtojet Eppendorf microinjector. זריקה מוצלחת היא דמיינו בקלות באמצעות הפצת לצבוע מתיל ירוק בכל החדרים במוח העוברי. המחט ואז הסיר לאט על ידי ציור לגבות כדי למנוע שבירה.
6. Electroporation
- העובר מוזרק (עדיין בתוך הרחם) מושם על גזה סטרילי שמעל בטנה של האם ורטוב ביסודיות עם מלוחים התחמם. שים לב ** תוספת של מלח על פני השטח קרום חיוני לאפשר מעבר יעיל של זרם חשמלי.
- אלקטרודות GenePaddle משמשים אחיזה הרחם בעקבות הזריקה של ה-DNA. חמש פולסים חשמליים רבועים של 40-50V ו 50 ms מועברות בקצב של הדופק אחד לשנייה באמצעות מערכת ECM8300 BTX electroporation (איור 1C, C ").
- מכסים את העובר מוזרק / electroporated עם גזה רטוב מגן להמשיך העובר הבא.
- עם השלמת הזריקה / electroporation של כל העוברים הרצוי, בזהירות לדחוף את קרני הרחם בחזרה לתוך הבטן (1D איור).
- הסר בזהירות את קרן הרחם אחרים ולהתחיל שוב עם העובר הקרובים השחלה.
7. תפר ועל הידוק
- לאחר עוברים כל חזרה בתוך הרחם, להוסיף חלל הבטן ~ 2-3 מ"ל סליין חם.
- כדי לסגור את הפצע, להתחיל על ידי הסרת גזה על הבטן וזיהוי הצדדים של הצפק. בגין תפירת הצפק באמצעות קו משי שחור קלוע. לא מומלץ להשתמש תפר נספג עבור הליך זה כפי שהוא בדרך כלל חלש יותר ועלול להוביל דימום לאחר ניתוח וזיהומים. עוגן על קו הצפק הקרובים עצם החזה ולהמשיך לתפור ממנו העוגן. ודאו כי כל התפרים הדוקים, וכי אין איברים הבסיסית או העור כבר תפור בשוגג אל תוך הצפק. קליפ קו תפר הנותרים וזורקים.
- משוך העור נסגר מעל קו תפר עם מלקחיים. באמצעות 9 מ"מ רפלקס ™ סגירת העור סיכות, קליפ עור על הפצע, נזהרת שלא להדק את קו תפר מתחת, או למשוך את העור חזק מדי. השיטה המועדפת היא להחזיק את העור למעלה מהגוף עם מלקחיים, ולבוא בזווית של 90 מעלות עם כלי עיקרי. המשך עד הפצע סגור (כשלושה סיכות). פעם סיים, להבטיח סיכות צמודים על ידי לחיצה בעדינות יחד עם הכלי תפר (1D איור ').
8. לאחר טיפול כירורגי
- כדי לפקח על התאוששות הרדמה, להפוך נשים על בטנה להפוך isoflurane משם. שמירה על פניו של בעל חיים בתוך מנגנון הנשימה, פונים חמצן עד 3% כדי לסייע ההתאוששות מן ההרדמה. בעלי חיים יש להציב על משטח גזה נקי ויבש על גבי כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה.
- בעוד החיה הוא מטושטש, להזריק 2 פתרון מ"ל רינגר תת עורי מתחת לעור הצוואר של החיה.
- המשך החזקת בעלי חיים תחת זרימת חמצן במשך מספר דקות ו גזה כריות חימום על מנת לעורר את החיה. בפרצים קצרים של תנועה מן החי צריך להיות כפי שנצפה הוא חוזר לאותו דפוס נשימה תקין. שימו לב כמה דקות עד חיה נראה מודע ער.
- תרסיס הבטן של הנקבה עם גנטמיצין ספריי לעטוף את החיה פד גזה סטרילי.
- מעבירים את החיה לכלוב סטרילי עם מצעים autoclaved ודיור קרטון.
- בקבוקי מים יש לנקות ביסודיות, מעוקרים ומלא מים סטריליים. עד 500 מ"ל מים להוסיף 2 מ"ל של אנטיביוטיקה sulfamethazine (25% מניות).
- ניהול 0.05 מ"ג / ק"ג עצירות תת עורי את הניתוח הבא בבוקר.
- צג הנשי מקרוב במשך 24 השעות הראשונות שלאחר הניתוח. אם בעלי החיים מוחזקים יותר מ 24 שעות, נקבות מועברים ster חדשאיל כלובים ביום 2.
9. נציג תוצאות
הניאוקורטקס
הניאוקורטקס הוא אזור של מערכת העצבים המרכזית האחראית חזותית הסנסורית עיבוד התפקוד הקוגניטיבי גבוה יותר. היא מורכבת של נוירונים הקרנת glutamatergic ו interneurons GABAergic המופקים telencephalon הגבי ו הגחון, בהתאמה. כדי להתמודד עם התפקידים של גנים שונים בהתפתחות neocortical, אנו משתמשים electroporation ברחם כדי misexpress או לחסום את הביטוי (כלומר, באמצעות בונה shRNA) של גנים שונים telencephalon הגבי או הגחון 1,3,4. כדי misexpress גנים telencephalon העוברי, אנו משתמשים וקטור ביטוי bicistronic (pCIG2), המכיל CMV-βactin האמרגן-משפר ואתר פנימי כניסה הריבוזום (IRES) משופרת חלבון הפלואורסצנט הירוק (EGFP; ב pCIG2) קלטת, ומאפשר transfected תאים כדי להתגלות על ידי epifluorescence (איור 2A-C). השתמשנו בטכנולוגיה זו כדי להציג את בונה ביטוי לתוך telencephalon מן E11.5 כדי E15.5 (הנתונים המוצגים נמצאת E12.5;. איור 2). בכך שהוא מאפשר לפתח עוברים מספר ימים לאחר electroporation, אנו מסוגלים לעקוב אחר בידול והגירה של ה-GFP שכותרתו אבות. במהלך ההתמיינות, 3 ימים לאחר electroporation GFP + תאים להבדיל ולהעביר מתוך אזור חדרית (VZ), אזור subventricular (svz) לבין אזור ביניים (איז) לתוך הצלחת קליפת המוח (CP,. איור 2C). אם המוח electroporated ב E12.5 מנותחים לאחר 24 שעות, אנו יכולים לעקוב אחר המתרחש בתחילת ההתבגרות אבי והגירה העצבית על ידי תיוג משותף עם סמנים של אבות apical (כלומר, Pax6;. איור 2 א), אבות הבסיס (כלומר, Tbr2; . איור 2B) ו נוירונים neocortical postmitotic (כלומר, Tbr1;. איור 2C).
Diencephalon
ההיפותלמוס נמצא בבסיס הגחון של מערכת העצבים המרכזית ואת הפונקציות כשער בין האנדוקרינית ומערכת העצבים האוטונומית. במהלך הפיתוח, גרעינים רבים שמרכיבים את ההיפותלמוס בוגרת להבדיל מאזור אב משותף הקווים באזור הגחון ביותר של diencephalon העוברית. נכון לעכשיו, מסלולים מולקולריים המווסתים תאים ובתאים שגשוג, התמיינות נוירונים והקמת גרעינים ההיפותלמוס הם הבינו היטב. השתמשנו ב electroporation ברחם למקד גן ביטוי הכתב diencephalon העובר על ידי הזרקת DNA לתוך 3 rd החדר של E12 embryos.We אז בעקבות הפצה של ה-GFP להבדיל נוירונים ב E14. בעזרת מתודולוגיה זו, יש לנו ממוקד בהצלחה ביטוי של GFP אל התלמוס, טרום התלמוס וההיפותלמוס (איור 3A). ניתוח סעיפים העטרה מגלה כי יש לנו ביטוי ממוקד בהצלחה GFP כדי ובתאים כי קו חדרית אזור של 3 rd החדר ועל נוירונים נודדים אל אזור המעטפת כדי ליצור גרעינים (איור 3 ב)
רשתית
הרשתית היא שכבה עצבית של העין, האחראית על המרת פוטונים האור לאימפולסים חשמליים המועברים למוח. זה מתפתח outpocketing diencephalon של העובר, ולכן, נגזר הצינור העצבי. הרשתית העצבית מתפתח מתא אב apical שנמצאת בסמוך למרחב subretinal, חלל שמפריד את העין מן mesenchyme את הראש. מיקוד בונה DNA על אבות הרשתית ולכן דורש זריקות עשויים לאזור יעד קטן. שימוש micromanipulators, הצלחנו בהצלחה יעד זה אזור קטן מן העוברים E13.5 כדי E15.5 (המוצג E15.5 electroporations של pCIC עם הכתב mCherry; איור 4).. אם רשתיות electroporated נבחנים 24 שעות שלאחר transfection, אנו צופים כי מרבית התאים + mCherry נמצאים בשכבה החיצונית neuroblast (onbl), שם ממוקמים חלוקת אבות, ולא את השכבה הגנגליון ברשתית תאים (gcl; תמונה הבלעה), היכן למקם תאים postmitotic.
באיור 1. מבוא ב electroporation ברחם הגדרת ומתודולוגיה. (א) רכיבי מפתח של כירורגית הגדרת לכלול Femtojet Eppendorf microinjector (1), micromanipulator Narishige עם בעל מחט (2), steromicroscope לייקה (3), תאורת סיבים אופטיים מערכת (4), ECM 830 Wave כיכר electroporation מערכת עם אלקטרודות (5) ו - כרית חימום (6). (א ') בעל חיים הוא מורדם באמצעות הרדמה מאדה עבור isoflurane. (ב ', ב') בקיצור, אחרי הרדמה, קרניים הרחם נחשפים ו-DNA מעורבב עם ירוק מהיר מוזרק לתוך שלפוחית המוח העוברי. זריקה מוצלחת היא דמיינו על ידי מעקב של צבע ירוק מהיר (ב '). (C, C ') אחרי ה-DNA מוזרק בהצלחה, האלקטרודות ההנעה ממוקמות משני צדי הרחם, positioning את העובר, כך ה-DNA יהיה משך לכיוון הקוטב החיובי לאזור המוח של בחירה. (ד ', ד') לאחר כל עוברי הרצוי מוזרקים, הרחם הוא דחף בחזרה לתוך הבטן (ד), הצפק הוא sutured, ואת העור מהודקים (ד '). הנקבה בהריון מותר אז להתאושש את הגורים electroporated נאספים בנקודות הזמן הרצוי.
איור 2. למשל נציג electroporation telencephalic הגבי. (AC) Photomicrograph קטע העטרה דרך telencephalon E13.5 הגב electroporated ב E12.5 עם pCIG2. Electroporated GFP בתאים + מנותחים לביטוי שלהם סמנים של אבות apical (Pax6 +, אדום), אבות הבזליים (Tbr2 +, אדום, B) נוירונים postmitotic (Tbr1 +, אדום, ג). צלחת cp, קליפת המוח; svz, אזור subventricular, VZ; אזור חדרית.
איור 3. למשל נציג electroporation diencephalic. (א) להציג הגחוני של המוח E14 כי כבר electroporated ב E12 עם pCIG2. GFP epifluorescence גלוי בתלמוס, טרום התלמוס וההיפותלמוס, הוכחת את התפשטות pCIG2 microinjected פלסמיד ברחבי החדר 3 rd. (ב) Photomicrograph סעיף העטרה דרך המוח electroporated, המציג את הנדידה של ה-GFP + תאים מחוץ לאזור חדרי לתוך אזור המעטפת, שם גרעינים ההיפותלמוס יהוו. 3V, החדר השלישי; T, התלמוס; היי, ההיפותלמוס; mz, המעטפת אזור: תל, telencephalon; pret, prethalamus: VZ, אזור חדרית.
איור 4. למשל נציג electroporation הרשתית. סעיף העטרה דרך עין E16.5 electroporated עם pCIC ב E15.5 מראה את הצטברות של תאים mCherry + בשכבה החיצונית neuroblast ולא Brn3b + לתאי הגנגליון ברשתית בשכבת תא גנגליון. הבלעה היא התמונה בהגדלה גבוהה יותר של האזור בארגזים. gcl, הגנגליון ברשתית שכבת התא; le, עדשה: שכבת onbl, neuroblast החיצוני; מחדש, הרשתית.