מאמר זה יתמקד דור האנדודרם הכבד האנושי אנושי אוכלוסיות תאים גזע עובריים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים
במאמר זה
סיכום
תקציר
למרות ההתקדמות רעילות התרופה דוגמנות אדם, תרכובות רבים נכשלים במהלך הניסויים הקליניים, בשל תופעות לוואי צפויות. העלות של מחקרים קליניים הם משמעותיים, ולכן חיוני יותר מסכי הרעלים חזוי מפותחים לפרוס בשלב מוקדם של פיתוח התרופה (Greenhough et al 2010). Hepatocytes האדם מייצגים את המודל הנוכחי זהב סטנדרטי להערכת רעילות התרופה, אבל הם משאב מוגבל כי התערוכה פונקציה משתנה. לכן, השימוש של שורות תאים ורקמות הנציח במודלים של בעלי חיים מועסקים באופן קבוע בשל השפע שלהם. בעוד שני מקורות מידע, הם מוגבלים על ידי פונקציה עניים, השתנות המינים ו / או חוסר יציבות של תרבות (Dalgetty et al 2009). בתאי גזע pluripotent (PSCs) הם מקור חלופה אטרקטיבית של hepatocyte אדם כמו תאים (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs מסוגלים התחדשות עצמית והבחנה לכל סוגי תאים סומטיים נמצא המבוגר ובכך מייצגיםמקור פוטנציאלי בלתי נדלה של תאים מובחנים. פיתחנו הליך פשוט, יעיל ביותר, מקובל אוטומציה התשואות HLCs אדם תפקודית (Hay et al 2008; פלטשר et al 2008; חנון et al 2010; פיין et al 2011 ו Hay et al 2011). אנו מאמינים כי הטכנולוגיה שלנו יוביל לייצור להרחבה של HLCs עבור גילוי תרופות, מחלות דוגמנות, בניית חוץ הגשמי מכשירים סלולריים ואולי טיפולים להשתלה מבוסס.
פרוטוקול
1. הכנה ראשונית של כל מניות הכימיה ציפוי של תרבות plasticware
כל השלבים להתבצע במנדף בתרבית רקמה בתנאים aseptic.
- הכנה של האדם גורם גדילה בסיסי פיברובלסטים (hbFGF)
- הכן 10% פתרון BSA ב PBS ולסנן דרך פילטר 0.22 מיקרומטר.
- מתוך הפתרון BSA 10% להכין פתרון 0.2% BSA.
- הוסף 10 מ"ל 0.2% BSA hbFGF so....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פיתחנו מודל פשוט, הומוגנית לשעתקו מאוד במבחנה כדי לייצר רמות להרחבה של HLCs האדם. המודל שלנו קיבל תוקף על ידי מספר מעבדות פעולה חיצוניים. אנו שגרתי לאפיין בתאי גזע שמקורם HLCs באמצעות ארגז הכלים שלנו לבית של סמנים התפתחותי מסוים מבחני תפקודי כבד (שרובם זמינים מסחרית). שלבים קריטיים בתהליך שלנו הן: שמירה על תא גזע pluripotency; היכולת לכוון תא גזע האנדודרם בידול מוחלט, את המפרט של תרבויות הומוגניות של האנדודרם הכבד ואת היכולת להפיק האנדודרם הכבד בוגרת מציג פונקציה מגוון רח.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
ד"ר חי נתמכה על ידי מלגה RCUK, ד"ר המערבית נתמכה על ידי מחלקת כירורגיה, ד"ר Medine נתמך על ידי מענק מהקרן Core BHF, מר בלטסאר Lucendo-Villarin נתמכה על ידי דוקטור MRC Studenship. ד"ר ג'ואו נתמכה על ידי מלגה מהממשלה הסינית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
Matrigel לוחות ציפוי צלוחיות
- Matrigel (10 מ"ל, BD Biosciences, בריטניה); חנות ב -20 ° C.
- KO-DMEM (500 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); חנות ב 4 ° C.
- תרבות רקמות צלחות (6 טוב, 12 טוב, קורנינג, בריטניה)
- תרבות רקמות צפחת (25 CM2 פרקו, קורנינג, בריטניה)
hESC תחזוקה
- עכבר בינוני פיברובלסטים עובריים מותנה (MEF-CM) (100 מ"ל, R & D מערכות, ארה"ב); חנות ב -20 ° C.
- פתרון BSA (50 מ"ל, סיגמא אולדריץ', בריטניה); חנות ב 4 ° C.
- צמיחה האדם הבסיסיות גורם פיברובלסטים (100 מיקרוגרם, Peprotech, ארה"ב); חנות ב -20 ° C.
HESCs Passaging עם collagenase
- גם בקבוק ומחוברות או hESCs.
- Matrigel בארות מצופה צלוחיות או על פי הצורך.
- Phospate שנאגרו מלוחים (-MgCl 2,-CaCl 2) (500 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); לאחסן בטמפרטורת החדר.
- Collagenase IV (1 גרם, Gibco, Invitrעוגן, בריטניה); חנות ב 4 ° C.
- עכבר בינוני פיברובלסטים עובריים מותנה (MEF-CM) (100 מ"ל, R & D מערכות, ארה"ב).
- צמיחה האדם הבסיסיות גורם פיברובלסטים (100 מיקרוגרם, Peprotech, ארה"ב).
דיפרנציאציה של hESCs האנדודרם אל הכבד
- RPMI 1640 (500 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); חנות ב 4 ° C.
- B27 מוסף (10 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); חנות ב -20 ° C.
- Activin (2 מיקרוגרם, Peprotech, ארה"ב); חנות ב -20 ° C.
- רקומביננטי עכבר Wnt3a (2 מיקרוגרם, R & D מערכות, ארה"ב); חנות ב -20 ° C.
- KO-DMEM (500 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); חנות ב 4 ° C.
- KO-SR (500 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); חנות ב -20 ° C.
- ללא חומצות אמינו חיוניות (100 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); חנות ב 4 ° C.
- β-Mercaptoethanol (10 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); חנות ב 4 ° C.
- DMSO (סיגמא אולדריץ', בריטניה); לאחסן בטמפרטורת החדר
- ליבוביץ L-15 תרבות בינוני (500 מ"ל, Sigmאולדריץ', בריטניה); חנות ב 4 ° C.
- Tryptose פוספט מרק (100 מ"ל, סיגמא אולדריץ', בריטניה); חנות ב 4 ° C.
- Foetal שור בסרום, חום מומת (500 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); חנות ב -20 ° C.
- 21-hemisuccinate (100 מ"ג, סיגמא אולדריץ', בריטניה) הידרוקורטיזון: חנות ב -20 ° C.
- אינסולין (הלבלב שור) (100 מ"ג, סיגמא אולדריץ', בריטניה); חנות ב -20 ° C.
- L-גלוטמין (100 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); חנות ב -20 ° C.
- חומצה אסקורבית (25 גרם, סיגמא אולדריץ', בריטניה); חנות ב -20 ° C.
- האדם HGF (10 מיקרוגרם, Peprotech, ארה"ב); חנות ב -20 ° C.
- רקומביננטי Oncostatin M האדם (OSM) (50 מיקרוגרם, R & D מערכות, ארה"ב); חנות ב -20 ° C.
- מזרק מונעת יחידת מסנן 0.22 מיקרומטר (Millipore, בריטניה)
אפיון האנדודרם נגזר hESC כבדית
Immunostaining
- פוספט חיץ מלוחים (-MgCl 2,-CaCl 2) (500 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); stoמחדש בטמפרטורת החדר.
- PBST, PBS מורכב עם 0.1% tween 20 (Sigma-Aldrich, בריטניה).
- Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, בריטניה) מורכבת ב-PBS, חנות -20 ° C.
- גליצרול (Sigma-Aldrich, בריטניה), לאחסן בטמפרטורת החדר.
- טריס Base (Sigma-Aldrich, בריטניה), לאחסן בטמפרטורת החדר.
- אתנול
- סרום (עבד Serotech, בריטניה), לאחסן ב -20 ° C.
- נוגדן משניים, fluorophores אלקסה (בדיקות מולקולריות, Invitrogen, בריטניה).
- MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, ארה"ב) מורכב ב טריס HCL וגליצרול כמו לכל הוראות היצרנים. DAPI (פירס, תרמו פישר סיינטיפיק, בריטניה) הוא הוסיף הפתרון MOWIOL בדילול 1:1000.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ראשי נוגדנים | |||
| Antigen * | סוג | ספק | מהילה |
| Alb | חד שבטיים עכבר | סיגמא אולדריץ' | 1 / 5 00 |
| E-cadherin | חד שבטיים עכבר | Millipore | 1 / 100 |
| α-fetoprotein | חד שבטיים עכבר | סיגמא | 1 / 500 |
| SSEA-4 FITC | חד שבטיים עכבר | Biolegend | 1 / 100 |
| IgG | חד שבטיים עכבר | DAKO | 1 / 500 |
| משני נוגדנים | |||
| אנטי עכבר FITC המצומד | חד שבטיים עיזים | Invitrogen | 1 / 400 |
טבלה 2. הנוגדנים המשמשים hESC נגזר immunostaining הכבד האנדודרם, בריכוזים השתמשו, המינים התפתחו וחברות שהם שנרכשו.
ניתוח פונקציונלי של האנדודרם הכבד Normalisation (לכל חלבון מ"ג)
ss = "jove_step"> מבחני ציטוכרום P450
- P4-Glo CYP3A4, CYP1A2, ערכות ו luminometer (Promega, ארה"ב).
- לבן קרקעית שטוחה 96 גם assay צלחת (BD Biosciences, בריטניה).
- BCA Assay Kit (פירס, תרמו פישר סיינטיפיק, בריטניה).
- Assay שקוף 96 צלחת גם (Iwaki, בריטניה)
מקורות
- Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).
- Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
