בידוד של תאים חיסוניים פונקציונלית לב

סיכום

שיטה זו של בידוד תאים חיסוניים פונקציונלי מהלב מספק אלטרנטיבה בשיטות המקובלות של collagenase העיכול, מה שגורם לתא רצויות הפעלת המערכת החיסונית, וכתוצאה מכך תגובה לירידה של תאים אלה. השיטה שלנו של בידוד התשואות תפקודית תאים חיסוניים לב על ידי הימנעות בעיות הקשורות עיכול אנזימטי.

תקציר

תאים חיסוניים לב צוברים ריבית התפקידים שהם ממלאים שיפוץ הפתולוגי במחלות לב רבים ^1-5 אלו תאים חיסוניים, הכוללים תא הפיטום, T-תאים מקרופאגים;. לאחסן ולשחרר מגוון של מתווכים פעילים ביולוגית כולל ציטוקינים פרוטאזות כמו tryptase. ^6-8 מתווכים אלה הוכחו להיות שחקני מפתח מטבוליזם תאי מטריקס ידי הפעלת metalloproteinases מטריצה ​​או גרימת הצטברות קולגן על ידי פונקציית ויסות fibroblasts 'לב. ^9-11 עם זאת, הטכניקות הזמינות עבור לבודד תאים חיסוניים יש לב היה בעייתי כי הם משתמשים collagenase חיידקי לעכל את רקמת שריר הלב. טכניקה זו גורמת להפעלה של תאים חיסוניים, ולכן אובדן תפקוד. לדוגמה, תא הפיטום לב להיות קשוב באופן משמעותי פחות תרכובות הגורמות degranulation. ¹² לפיכך, אנו פיתחו שיטה המאפשרת tהבידוד של תפקודי לב תאים חיסוניים אשר יוביל להבנה טובה יותר של התפקיד של תאים אלה במחלת לב הוא. ^{13, 14}

שיטה זו מחייבת היכרות עם המיקום האנטומי של xiphoid השחי של החולדה תהליך, רצועה falciform, ואת קרום הלב של הלב. ציוני דרך אלו חשובים כדי להגדיל את ההצלחה של ההליך כדי להבטיח תשואה גבוהה יותר של תאים חיסוניים לב. תאים אלו מבודדים החיסונית הלב יכול לשמש לאפיון הפנוטיפ של פונקציונליות, בגרות, ושיתוף תרבות ניסויים בתאי לב אחרים כדי להשיג הבנה טובה יותר של האינטראקציות שלהם.

פרוטוקול

1. הכנת פתרון "הנקס מאזן מלח (HBSS)

1. החיטוי 1 כוס כוס L, סיים את 1000 מ"ל גליל, ומערבבים בר.
2. מחדש את אבקת פתרון HBSS את כוס L autoclaved 1 כוס לציון 900 מ"ל עם מים מזוקקים כפול.
3. מערבבים פתרון HBSS עם 3.4 גרם של מלח Na + Hepes ולהתאים את ה-pH לערך בין 7.35-7.41 שימוש או HCL מרוכז או NaOH.
4. לאחר pH הרצוי שהושגה ונשאר יציב, להוסיף 5 גרם של אלבומין בסרום שור לפתרון בטמפרטורת החדר עד אלבומין הוא נמס לגמרי.
5. הוסף 10 מ"ל של מים מזוקקים אנטיביוטיקה, antimyotic, לפתרון כפולה עד הנפח הכולל עומד בסימן מ"ל 1000.
6. מערבבים היטב את הפתרון.
7. סנן הפתרון HBSS ולהפריד אותו לתוך צינורות 50 מ"ל פלקון לשימוש מאוחר יותר. צינורות נוספים אפשר להקפיא ולהשתמש בהם במועד מאוחר יותר.

2. בעלי חיים Preparation - החדרת צינורות לקנה הנשימה

1. להכין מגש עם מכשירים נדרש חומר החדרת צינור לקנה הנשימה (כלומר מלקחיים, מספריים, צינור לקנה הנשימה, 3-0 תפר שחור קלוע, הנשמה חיה קטנה, וכו ').
2. לאחר עכברוש הוא מורדם לחלוטין עם קוקטייל קטמין / xylazine ביחס של 2 ל קטמין xylazine 1, לגלח את הבטן, החזה, הגרון של החולדה. כדי להבטיח מדינה עמוק הרדמה הושגה, קמצוץ הבוהן של החולדה ולבדוק לנסיגה הדוושה של איבר. ודא עכברוש הוא הרדים עמוק לפני ביצוע כל החתכים.
3. מניחים את עכברוש עם ראש מורם על קרש חיתוך, כי הוא נוטה על 30 מעלות זווית
4. ביצוע חתך בעור מהבטן באמצע כדי מתחת ללסת התחתונה. משם לנתח את שרירי המשולש הקדמי של הצוואר כדי לחשוף את קנה הנשימה.
5. מניחים תפר 3-0 קלוע שחור מתחת לקנה הנשימה.
6. עושים חתך קנה הנשימה בין טבעות סחוסד להכניס את צינור לקנה הנשימה. עניבה תפר חזק כדי לאבטח את צינור לקנה הנשימה על קנה הנשימה.
7. חברו את צינור לקנה הנשימה כדי הנשמה חיה קטנה.

3. כלי הכנה בידוד תא החיסון

1. להכין מגש עם מכשירים את ההליך תא החיסון בידוד (כלומר מלקחיים, מספריים, HBSS, גזוז רך טפלון 24 מד בקסטר intravascular מעל המחט מהיר קת')
2. הכן שני מזרקים 10cc, מילוי במזרק אחד עם HBSS מציגה החיץ לתוך שק קרום הלב ואת מילואים והשני עבור aspirating התאים המכילים HBSS.

   3.2.1. מנמיכים את קצה טפלון של 24 מד בקסטר intravascular על (1.6 ס"מ) מהירה קת' על ידי מחט 1 / 2 עד 3 / 4 אורך המקורי עבור ההליך בבידוד.

3. שמים את כל מזרקים, מאגרים, ואת ריקה 15 מ"ל Tube פלקון (להחזיק את נוזל חילוץ פעם ההליך הסתיים) על קרח.

<בכיתה p = "jove_title"> 4. תא החיסון בידוד

1. ביצוע חתך קו האמצע של דופן הבטן (לאורך linea alba) עד שתגיע תהליך xiphoid.
2. החל מעט רוחבית לתהליך xiphoid, לעשות חתכים דו צדדי דרך כלוב הצלעות המשך בזווית כלפי השחי. להיזהר לא לנקב את הריאות, הלב, או קרום הלב.
3. לאחר חתכים משני צדי החזה הושלמו, משם לנתח את הסרעפת מן הצלעות התחתונות, חיתוך לרוחב המדיאלי.

   הערה: שימו לב אי פעם של קרום הלב שבו מתחבר הסרעפת ועצם החזה כדי למנוע נזק. השתמש ברצועות falciform כציון דרך לציין היכן קרום הלב מחוברת בצד השני של הסרעפת. כמו כן, אם קרום הלב הוא חתך, היכולת לבודד תאים אבוד.

4. הרם בעדינות צד אחד של בית החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה והלב (במארז עדיין קרום הלב).
5. קח את המזרק מלא HBSS ולמצוא טעם שק קרום הלב בערך בחצי הדרך בין עצם החזה ואת הלב (רצוי יותר מקורי מאשר הזנב) והכנס את קצה טפלון של מקוצר מהיר קת' דרך שתי שכבות של קרום הלב.
6. לאחר קטטר נמצא במקום, המשך בעדינות למלא את החלל עם קרום הלב מ"ל 2-3 של החיץ HBBS. אתה יודע מיד אם את הקטטר ממוקם כראוי כאשר אתה מבחין החלל קרום הלב מתרחב. אם אין הוא ממלא עדים, לסגת למקם את מהיר קת'.
7. כאשר שק קרום הלב מתמלא, לקחת את המזרק השני 10 סמ"ק והמקום טיפ בחזרה קרום הלב ולהתחיל aspirating החיץ. חור הכניסה אותו ניתן להשתמש בו או אחרת ניתן ליצור. ודא קצה לא להתקרב יותר מדי אל קירות שק קרום הלב תוך מתן יניקה, בעיקר על החלק התחתון של הלב. זה יכול להוביל ניקוב שק אובדן קרום הלב ושל תא תא המכילs.
8. בעוד aspirating החיץ, קצה הצנתר ניתן להעביר מסביב על מנת לאסוף חיץ ככל האפשר בתוך שק קרום הלב.

הערה: אם בכך אתה קצת לקרוע את קרום הלב ולעשות את החור בחלק העליון של הלב גדול יותר מאשר חור המקורי, אין פאניקה. כל עוד קרום הלב עדיין מקיפה מספיק של הלב אתה עדיין יכול לבצע עוד לשטוף הלב אם כי עם כמות פחותה של המאגר. עבור אוסף של כמות אופטימלית של תאים, 03:57 רוחץ נוספים נדרשים.

9. מניחים את החיץ חילוץ לתוך צינורות פלקון שהונחו על קרח.
10. הסר את הלב, הריאות, ו / או כל רקמה אחרת במידת הצורך למחקרים נוספים. לאחר איסוף של תאים חיסוניים ורקמות אחרות, החולדה צריכה להיות במהירות המתת חסד הומנית.
11. צנטריפוגה את הדוגמאות שנאספו תא החיסון במשך 10 דקות ב 200 גרם ב 4 ° C. שמור תמיד את הצינורות על הקרח כאשר אינו בשימוש.
12. הסר את supernatant ו מחדש את גלולה ב 1 מ"ל של הצפת Hyclone או HBSS.

הערה: חשוב לספור את מספר תאים חיסוניים המתקבל לב לאחר כל הליך תא החיסון בבידוד.

5. נציג תוצאות:

דוגמה מבודדים תאים התורן הלב שהושגו עם הטכניקה הזו מוכתמת toluidine כחול safranin O / alcian כחול מוצגות דמויות 2 א ו -2, בהתאמה. כפי שניתן לראות באיור 3, התורן לב, שמרו על יכולתם שחרור היסטמין לאחר טיפול activators ידוע כגון 48/80 המתחם חומר P כמתואר מורגן et al. ⁹ פיזור נציג מגרשים מתוך cytometry הזרימה של תאים מסוג CD4 + CD8 + תאים מוצגים נתוני 4 ו -5, בהתאמה. לימפוציטים מסוג T מזוהים נוספים phenotyped כאוכלוסייה התא טכניקה זו.

ss = "jove_content">
באיור 1. תרשים זרימה של תהליך הבידוד לב החיסונית התא.

. באיור 2 תמונות נציג היסטולוגית של תא הפיטום לב מוכתמות כדלקמן: (א) עם toluidine כחול (B) הם safranin O / alcian כחול.

באיור 3. מחקר פונקציונלית של תא הפיטום לב מבודד באזור שריר הלב epicardial ועורר עם 48/80 מתחם (10μg/mL) ו חומר P (10μM).

איור 4. הנציג cytometry זרימה פיזור חלקות CD4 + תאים מבודדים שכותרתו עם חומר P (1:100 dilutיון).

איור 5. Cytometry זרימה נציג בודד CD8 + תאים עם חומר הנקרא P (1:100 דילול).

דיון

שיטה זו של בידוד תאים חיסוניים לב מאפשר ניתוח של תפקידם, פנוטיפ, ובגרות ללא הפעלה לא רצויה, כי בדרך כלל מתרחשת במהלך טכניקה הבידוד המסורתי האנזימטית העיכול. המספר הכולל הממוצע של תאים שהושגו עם טכניקה זו היא בסביבות 400,000 דולר הלב העכברוש, מכתים דיפרנציאלי cytometry ניתוח תזרים של תאים אלה מציין אוכלוסייה מעורבת של לימפוציטים מסוג T (~ 70%), מקרופאגים (~ 12%) עם תא הפיטום השימוש בטכניקה זו. (~ 12%). ^{13, 14} לכן, שיטות טיהור להפרדה נוספת של לב אוכלוסיות תאים חיסונ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב וציוד	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
מלח מאוזן הנקס "	סיגמא	H4891	בקבוק אחד עושה 1 ליטר של מלח מאזן "הנקס פתרון. מאזן מלח מחדש הנקס " הפתרון כחלק מן ההליך.
לאנטיביוטיקה Antimyotic	Gibco	15240-062
HEPES	סיגמא	H3784
שור סרום אלבומין	סיגמא	A3912
בקבוק 250 מ"ל סינון Nalogene	Thermoscientific	157-0020
12 N-HCL	פישר סיינטיפיק	CAS 7647-01-0	במשך 6 N, להוסיף כמויות שוות של HCL כדי deionizedהמים.
10 N NaOH	פישר סיינטיפיק	SC267	במשך 5 N, להוסיף כמויות שוות של NaOH למים deionized.
מים מזוקקים פעמיים

טבלה של ציוד ספציפיות:

שם מגיב וציוד	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
3-O תפר משי קלועה	Ethicon מוצרים	SA64H
בעלי חיים קטנים מאוורר	CWE Incorporated	SAR-830	הגדר קצב הנשימה עד 40.5 נשימות לדקה.
18 שפוע מחט מד	BD Biosciences	305199	חתוך על ידי מחט 1 / 2 עד 3 / 4 אורך המקורי לשימוש צינור לקנה הנשימה.
טפלון עצה (עם מחט הסיר) של 24-מד קטטר מהיר קת' בקסטר	בקסטר	2N111	מנמיכים את אורך עצה טפלון על ידי 1 / 2 עד 3 / 4.
10 סמ"ק מזרק	פישר סיינטיפיק	14-823-16B
15 מ"ל פלקון צינורות	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B בקירור צנטריפוגה	פישר סיינטיפיק	75-004-377	זכור מראש לצנן ולשמור על 4 ° C.
Hyclone	Thermoscientific	S300030.02
Hemocytometer	האוסר מדעי	HS-LB-1483