לימוד גיל תלויי חוסר יציבות הגנום באמצעות ס cerevisiae דגם כרונולוגי תוחלת חיים

סיכום

כאן אנו מתארים קבוצה של מוטציה מבחני DNA כי ניתן בשילוב עם המודל הכרונולוגי שמרים תוחלת החיים כדי לחקור את הגנים / מסלולים המווסתים או לתרום יציבות הדנ"א הגנומי במהלך ההזדקנות.

תקציר

מחקרים באמצעות מודל cerevisiae Saccharomyces הזדקנות חשפו תוחלת החיים המסלולים רגולטוריות אשר נשמרת חלקית אאוקריוטים גבוה ^1-2. הפשטות והכוח של המודל שמרים הזדקנות יכול גם להיחקר ללמוד נזק לדנ"א ותחזוקה הגנום, כמו גם תרומתם מחלות במהלך ההזדקנות. הנה, אנחנו מתארים מערכת ללמוד בגיל תלויי מוטציות DNA, כולל החלפות בסיס, מסגרת משמרת מוטציות, rearrangements כרומוזומליות ברוטו, ו הומולוגיים / homeologous רקומבינציה, כמו גם פעילות גרעינית תיקון DNA על ידי שילוב של כרונולוגי שמרים תוחלת החיים עם ה-DNA פשוטה נזק מבחני מוטציה. השיטות שתוארו כאן יש להקל על זיהוי של גנים / מסלולים המווסתים יציבות גנומית ואת המנגנונים העומדים בבסיס תלויי גיל מוטציות DNA וסרטן אצל יונקים.

פרוטוקול

שני מודלים תוחלת החיים יש בשימוש ללמוד ההזדקנות ס cerevisiae: RLS ו CLS. (ניצני) replicative תוחלת החיים (RLS) מבוססת על התצפית כי אמא תאים שמרים לעבור מספר סופי של המחלוקות ^3-6. אנו נתמקד את תוחלת החיים כרונולוגי (CLS), מודל המבוסס על הישרדות הכרונולוגי של שמרים אי חלוקת בתרבות או על צלחות ^7-11. שמרים סוג הפרוע שגדל אקספוננציאלית במשך 10-12 שעות סינטטי בינוני דקסטרוז (SDC) שלם . כאשר רמת הגלוקוז מפחית, מתגים שמרים מן התסיסה על הנשימה, תהליך שמכונה משמרת diauxic. התאים ממשיכים להתחלק לאט בשלב שלאחר diauxic במשך כ 48 שעות לפני הכניסה G ₀ מעצר. קצב חילוף החומרים של התאים נשאר גבוה עד יום 06/05 (יום 0 הוא היום חיסון). כדאיות התא לאורך זמן ניתן לגשת בשיעור של תאים הזדקנות כרונולוגית, נדגמו כל יומיים, אשר יכול לצאת G ₀ מעצר טופס מושבות על צלחות YPED עשיר.

1. כרונולוגי שמרים תוחלת החיים (CLS) בתרבות נוזלי

1. לחסן מושבה יחיד לתוך 1 מ"ל סינטטי בינוני גלוקוז מלאה (SDC, טבלה 1) ו דגירה לילה עם רועד (220 סל"ד) בשעה 30 ° C. שלושה inoculums ממושבות עצמאית צריך להיות מוכנים לכל מאמץ כדי לספק כל העתקים ביולוגיים.
2. לדלל את תרבות הלילה לתוך מדיום SDC טרי (בדרך כלל 10 מ"ל) ל OD = 0.05-0.1 (~ 1:100 דילול) ו דגירה עם רועד (220 סל"ד) בשעה 30 ° C. נקודה זו בזמן נחשב 0 יום ההזדקנות הכרונולוגי. יש לשמור על יחס של 1:05 נפח תרבות / צפחת (10 מ"ל תרבות ב 50 מ"ל, או לניסויים יותר / גדול 25 תרבות מ"ל 125 מ"ל), כדי להבטיח אוורור נאות.
3. החל מיום 3, להסיר 2 aliquots של μl 10 מהבקבוק, לדלל 10,000 פעמים במים autoclaved, 10 תרבות בדילול μl (כלומר, 10 -10 ⁴⁾ על YEPD (1% תמצית שמרים, 2% bacto peptone, דקסטרוז 2% , 2%) אגר צלחות לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 48-72 שעות לפני הקמת המושבה להתאחד (CFU) נספרת.
4. יום 3 CFU נחשבת הישרדות 100%. גורמי דילול של התרבות הזדקנות בימים שלאחר מכן צריך להיות בהתאם כדי להבטיח ~ 20-100 מושבות assay CFU (לדוגמא, 10 ⁴ -10, 10 -30 ^{4, 3} 10 -10, וכו '). עבור תאים מסוג בר ברקע DBY746, CLS מגיעה הישרדות 1% סביב 11 יום.

וריאציות של assay ב הכדאיות באתרו כוללים:

• הגבלת קלוריות (CR) על ידי הגבלה גלוקוז. דילול של תרבות לילה בינוני גלוקוז מוגבל SC (כמו 0.5% או 0.05 במקום גלוקוז 2% סטנדרטי) בדרך כלל להוביל צפיפות האוכלוסייה נמוכה הרוויה ביום 3, אבל הרבה המורחבת מתכוון המקסימלי (10% הישרדות) תוחלת החיים ^12.
• עבור CR קיצוני / רעב, לשטוף את תרבות יום 3 שלב נייח (בדרך כלל 10 מ"ל, כמו בשלב 3 לעיל) עם מים autoclaved (תאים resuspend נפח שווה של מים ספין למטה בסל"ד 2500 5 דקות, חזור 3 פעמים). תאים Incubationof במים מחקה את מצב הרעב כי שמרים עלול להיתקל בטבע. כל יומיים לאחר מכן, תרבות ההזדקנות יש לשטוף עם מים autoclaved ו resuspended נפח שווה של מים כדי להסיר כל החומרים המזינים שוחרר מן התאים המתים lysed. בצע assay הכדאיות של הדגימה התרבות הזדקנות כפי שתואר לעיל. מצב זה יהיה רעב הובילה כמעט הכפלה של CLS אומר את זן הבר סוג DBY746 ^12.

2. Assay ב הכדאיות באתרו

בתרבות נוזלי, חלק קטן של תאים עשויים לשרוד מחדש נכנסו מחזור התא ולצמוח תוך ניצול חומרים מזינים אלו הנותרים או טופס שוחרר lysed תאים מתים במדיום, פנוטיפ כינה לצמיחה מחודשת / מתנשם ^13. פיתחנו מערכת הכדאיות-on-a-צלחת כי מנצל את auxotrophy של זן DBY746 (trp1) לעקוף את לצמיחה מחודשת / מתנשם בעיה גם לאפשר את בדיקת ההשפעה של חשיפה קיפוח מתמדת של חומרים מזינים או חיצוני או לגירויים שונים על שמרים CLS ^11. זה ב assay הכדאיות באתרו גם מחקה את מודל replicative תוחלת החיים כך התאים נחשפים כל הזמן חומרים מזינים בשפע למשך ניתוח את תוחלת החיים.

1. לחסן מושבה יחיד לתוך 1 מ"ל סינטטי בינוני גלוקוז מלאה (SDC) ו דגירה לילה עם רועד (220 סל"ד) בשעה 30 ° C. לפחות שלושה inoculums ממושבות עצמאית צריך להיות מוכנים כל מאמץ כדי לספק העתקים ביולוגיים.
2. בואו התרבות לגדול ל ~ 10 ⁸ תאים / מ"ל (OD ₆₀₀ = ~ 10), לדלל את המים autoclaved culturewith ל μl 100-200 cell/10 (בדרך כלל 10 ⁴ פי דילול) ו 1000 cells/10 μl (10 ³ פי דילול).
3. פלייט two aliquots של μl 10-30 התרבות מדולל על אחד צלחת טריפטופן SDC הנשירה. עבורr כל זן, להכין סט של 8-20 צלחות שכותרתו לפי צפיפות ציפוי (לדוגמא, 10 ⁴ פי בדילול מלא, 10 μl צלחת או 10 ⁴ -10, 10 -30 ^{4, 3} 10 -10, 10 -30 ³ וכו '), אשר להבטיח 10-100 מושבות ניתן לספור לקראת הכדאיות ירד במהלך ההזדקנות.
4. דגירה את הצלחת להגדיר ב 30 מעלות צלזיוס למשך ניתוח את תוחלת החיים.
5. ביום ציפוי וכל 2 ימים לאחר מכן, הסר אחד צלחת ושחרר מבחינת להוסיף 0.5 מ"ל טריפטופן (2 מ"ג / מ"ל) על מנת לאפשר לתאים לגדול קיימא. דגירה את הצלחת על 30 מעלות צלזיוס למשך 48-72 שעות נוספות. הרוזן CFU עבור הכדאיות ביום בנוסף טריפטופן. CFU ביום ציפוי נחשבת הישרדות 100%.

וריאציות של assay ב הכדאיות באתרו כוללים:

• גיל תאים על צלחות אגר (בתנאי רעב קיצוני). הוסף 1 מ"ל 2x YPED במקום טריפטופן בימים שלאחר מכן, כדי לאפשר צמיחה CFU לספור ^14.
• גיל תאים על צלחות עם המדיום הנשירה טריפטופן להשלים סינתטי עם מקורות פחמן שונים, בריכוזים שונים, למשל של גלוקוז (הגבלת קלוריות על ידי הגבלה גלוקוז), מקורות פחמן שונים, כגון אתנול, גליצרול, חומצה אצטית ^14. הוסף 1 מ"ל גלוקוז / פתרון טריפטופן (גלוקוז 20% 1mg/ml טריפטופן) כדי לאפשר צמיחה לספור CFU.
• מניפולציה מזין אחרים, כגון חנקן.

3. ה-DNA נזק ותדירות מוטציה במהלך ההזדקנות הכרונולוגי

Canavanine התנגדות (יכול ^r) ו can1 רצף
תדירות מוטציה ספונטנית ניתן להעריך על ידי מדידת תדר של התנגדות canavanine (יכול ^r) בתרבויות כרונולוגית ההזדקנות. מוטציות בגן CAN1 (YEL063), אשר מקודד את ארגינין פלזמה permease, לדקלם תאים עמידים אנלוגי ארגינין L-canavanine.Can מושבות ^r שנאספו בנקודות זמן שונות ניתן גם לשמור על מיצוי של הדנ"א הגנומי וסדר הבאים של CAN1 הגן, אשר יכול לספק ספקטרום מוטציה נתונים (עם המודד מוטציה, SoftGenetics).

מאגר ההחלפות (TRP ⁺ reversions)

זנים עם trp1-289 מכילים מוטציה ענבר (C403T) ברצף TRP1 קידוד. מדידה של תדירות trp1-289 כדי חזרה ⁺ trp ¹⁵ מאפשר אמידה של שיעור התחלופה בסיס במהלך ההזדקנות הכרונולוגי שמרים.

Frame-Shift מוטציות

ליס ^- זן EH150 (מאטה, lys2ΔBglII, trp1-Δ, his3-Δ200, ura3-52, ade2-1o) נמלים מוטציה lys2ΔBgl השני שנבנה על ידי הוספת 4 נוקלאוטידים כדי ליצור אנזים II Bgl הגבלה אתר בגן LYS2 . כתוצאה מכך 4 משמרת במסגרת תוצאות לפתוח קריאה auxotrophy עבור ליזין כי יכול להיות הפוך על ידי ההוספה / המחיקה מוטציות קטנות ^16-17.

Rearrangements כרומוזומליות הגולמי (GCRs)

כדי לזהות rearrangements כרומוזומליות הגולמי (GCRs), אנו שנוצר זן מוטציה, שבה HXT13 (YEL069), קידוד טרנספורטר hexose מיותר מאוד, הופרע על ידי קלטת URA3 ^18. HXT13 ממוקם 7.5 kb telomeric כדי CAN1 על כרומוזום V. מוטציות הן CAN1 ו URA3 גנים להבהיר התנגדות התאים L-canavanine ו-5-fluoroorotic חומצה (5FOA), בהתאמה. בהתחשב בתדר נמוך של מוטציות נקודתיות המתרחשים בשני הגנים, ניתוח יכול ^{r r} 5FOA בתדירות מספקת הערכת GCRs כי לגרום לאובדן של גנים שניהם.

הומולוגיים ו homeologous רקומבינציה

כדי לבדוק את רמת הומולוגיים (100%) ו רקומבינציה homeologous (91%) במהלך ההזדקנות הכרונולוגי, אנו מוטנטים שנוצר בו פלסמידים לינארית (HIS3: אינטרון-IR-URA3) נשיאה או 100% חוזר הפוכה הומולוגיים (IRS) (pSR406 ) או 91% homeologous מס הכנסה (pSR407) בבית HIS3 מוקד ^19. רקומבינציה בין מס הכנסה מאפשר את הביטוי של חלבון His3 תפקודית.

1. במקביל assay הכדאיות רגילה (כמתואר לעיל), להסיר את הכמות המתאימה של תאים מתרבות הזדקנות,
   1. עבור מוטציה ^r יכול, להתחיל עם ~ 2x10 ⁷ תאים (200 μl של תרבות יום 3);
   2. עבור חזרה ⁺ TRP, להתחיל עם ~ 10 ⁸ תאים (500-1000 μl של תרבות יום 3);
   3. עבור מוטציה ליס מסגרת shift ^+, להתחיל עם ~ 10 ⁸ תאים (500-1000 μl של תרבות יום 3);
   4. עבור GCRs, להתחיל עם 2-3x10 ⁸ תאים (2-3 מ"ל של תרבות 3 יום);
   5. עבור רקומבינציה הומולוגיים ו homeologous, להתחיל עם & טילדה: 5x10 ⁷ תאים (200-500 μl של תרבות יום 3);
   להתאים את כמות ציפוי בהתאם לירידה הכדאיות הכולל והגידול בתדירות מוטציה במהלך ההזדקנות הכרונולוגי (טבלה 2). במקרה של זנים עם פנוטיפ hypermutator (כגון אלה עם ליקויים לתקן דנ"א), להפחית את כמות הדגימה בהתאם.
2. גלולה התאים עם מכונת הספסל העליון צנטריפוגה (6000 סל"ד במשך 5 דקות).
3. Resuspend תאים מ"ל מים 1 autoclaved ו גלולה התאים שוב.
4. Resuspend תא גלולה ב μl 100 מים. פלייט תאים,
   1. עבור מוטציה ^r, על ארגינין-הנשירה צלחות סינטטי בינוני שלם (SDC-Arg, בתוספת סולפט 60 L-canavanine מיקרוגרם / מ"ל) יכול;
   2. עבור חזרה ⁺ TRP, על טריפטופן-הנשירה צלחות (SDC-TRP);
   3. עבור מוטציה ליס מסגרת shift ^+, על ליזין-הנשירה צלחות (SDC-ליס);
   4. עבור GCRs, ב-ארגינין הנשירה צלחות (SDC-Arg) בתוספת 5FOA (1 מ"ג / מ"ל) ו-L-canavanine סולפט (60 מיקרוגרם / מ"ל);
   5. עבור רקומבינציה הומולוגיים ו homeologous, על היסטידין-הנשירה צלחות בתוספת גלקטוז (2%).
5. הרוזן CFUs לאחר דגירה ימים '04/03 בשעה 30 ° C. שכיחות המוטציה הוא מנורמל למספר תאים קיימא.

משלימים ב assay הכדאיות באתרו, תלויי גיל trp ⁺ חזרה, ליס ⁺ מסגרת משמרת מוטציה, רקומבינציה, או יכול ^r יכול להיות גם למד בתאים בני בצלחת.

1. פלייט תאים (~ 10 ⁸ תאים / צלחת) ל-TRP, ליס,, הנשירה שלו, או L-canavanine צלחות סינטטי בינוני שלם (כמתואר לעיל).
2. כל יומיים (או בנקודת הזמן של עניין), ציון המושבות המתהווה.
3. שכיחות המוטציה מוערך על ידי נרמול מושבות המתהווה למספר הכולל של תאים קיימא של היום הספציפי.

4. Translesion סינתזה (TLS)

הגיל תלויי תדר להגדיל מוטציה עשויה להיות כרוכה פגיעה מקרומולקולה מוגברת, הגנה הסלולר לתקן פחתה /, והגדילה תיקון DNA שגויים (כגון סינתזה-Polζ תלוי translesion, TLS) במהלך ההזדקנות. לדוגמה, האריכה ימים sch9 מוטנטים Δ התערוכה ביטוי גבוהות של SOD2, וירידה הביטוי של האנזים מועדת לטעויות תיקון דנ"א Rev1 ^20. כאן אנו מתארים assay שילוב תבנית דנ"א פגום ותמצית גרעיני שלם על מנת להעריך את TLS במבחנה.

1. הכנת תמצית גרעיני כפי שתואר על ידי וואנג ואח' ^21;. לכמת את ריכוז החלבון על ידי BCA assay (פירס).
2. הוסף 0, 5, 10 או 20 מיקרוגרם של תמציות גרעיני 50 (נפח סופי) תגובות μl המכיל מאגר TLS (20 HEPES מ"מ, 7 mM MgCl _2, 1 mM DTT, 25 mM NaCl, pH 7.8), 200 ו - 100 ננומטר μMdNTPs ^{5'-32-P-12-mer} שכותרתו פריימר (5'-CGA TGG TAC GGA-3 ") annealed לתבנית 48-mer המכיל נזק לדנ"א של עניין (5'-TCG ATA CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC ACG TCC GTA המרכז לאמנות עכשווית TCG-3 ", שבו X הוא אתר פגום, למשל, אתר abasic, 8-אוקסו-G, וכו ').
3. דגירה את התערובת על 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, לסיים את התגובה עם תוספת של 2.5 EDTA μl (20 מ"מ) 2 μl של proteinase K (10 מ"ג / מ"ל).
4. לטהר DNA עם מיצוי פנול משקעים אתנול.
5. Resuspend דנ"א μl 50 של חיץ טעינת ג'ל (98 לפוראמיד%, 20 mM EDTA, וצבע).
6. פתור את המוצרים סינתזה translesion על ג'לים polyacrylamide 19%.
7. לכמת את TLS באמצעות phosphorimaging (איור 1).

5. נציג תוצאות

אנחנו בדרך כלל השתמשו ספירת CFU ביום 3 כמו הישרדות 100 אחוזים ניתוח CLS תקן נוזלי. אחוז ההישרדות בימים שלאחר מכן ניתן להתקין כדי לחשב את הממוצע (50% הישרדות) והמקסימום (10% הישרדות) משתרע על פני החיים ^12. תוחלת החיים לתוצאות שהתקבלו בשנת assay הכדאיות באתרו הן בדרך כלל בקנה אחד עם אלה באמצעות assay CLS נוזלי, אך הפחית את תוחלת החיים כלומר, אשר נובע בחלקו מהעובדה התאים נחשפים כל הזמן חומרים מזינים. נוכחות של גלוקוז מעכב את הפעילות של הגנה הסלולר כמו הראה ידי transactivation מופחת של גורם שעתוק בתגובה ללחץ כגון Msn2 / 4 Gis1 ^12.

גיל תלויי תדר המוטציה משתנה מאוד בהתאם לרקע זן, מניפולציה גנטית, בתנאי תרבות, גיל. טבלה 2 מראה את התוצאות שהושגו טיפוסי זן wild-type (DBY746).

רכיב	g / L
D-גלוקוז	20
אמוניום סולפט	5
בסיס חנקן (-AS/-AA)	1.8
NaH2PO4	1.4
	מ"ג / ליטר
אדנין	80
L-ארגנין	40
L-חומצה אספרטית	100
L-חומצה גלוטמית	100
L-היסטידין	80
L-isoleucine	60
L-לאוצין	120
L-ליזין	60
L-מתיונין	80
L-פנילאלנין	60
L-סרין	400
L-תראונין	200
L-טריפטופן	80
L-tyrosine	40
L-valine	150
אורציל	80

טבלה 1. גלוקוז סינטטי בינוני מלא, SDC (להסתגל 6.0 pH עם NaOH). 4 פי עודף של היסטידין, לאוצין, טריפטופן, ו אורציל כלולים לפצות את auxotrophy של זן DBY746.

	יום 3 (ממוצע ± SEM)	עד (במהלך ההזדקנות)
R יכול	1.76 ± 0.12 x10 -6	6-8 x10 -6
TRP חזרה +	6.60 ± 1.70 x10 -8	1.60 x10 -6
ליס + מסגרת שינוי מוטציה	3.00 ± 0.78 x10 -8	.70 X10 -6
GCRs	0.62 ± 0.10 x10 -8	.30 X10 -6
הומולוגיים רקומבינציה	5.55 ± 2.74 x10 -6	27.00 x10 -6
Homeologous רקומבינציה	0.12 ± 0.04 x10 -6	.48 X10 -6

טבלה 2. תדרים מוטציה אופיינית של תאים מסוג בר (DBY746) במהלך ההזדקנות הכרונולוגי.

באיור 1. תוצאה של סינתזה translesion (TLS) ^20. תמציות גרעיני משלב היום בן 3 נייח wild-type (DBY746) ו sch9 Δ תאים מוטנטים הודגרו עם אתר המכיל תבניות ניזוק או abasic DNA למשך 30 דקות בקצב של 30 ° C. TLS מוצרים מסומנים על ידי מוצק (עם תבנית ניזוק) או מנוקד (עם תבנית פגומים) שורות. אין סינתזה translesion שנצפתה תמצית גרעיני sch9 מוטנטים Δ. Primers חינם מסומנים על ידי חץ הפתוח.

דיון

תרבויות הזדקנות נוזלי מתישהו התערוכה לצמיחה מחודשת / פנוטיפ מתנשם ^13, אשר מסבך את ניתוח CLS. לצמיחה מחודשת מתרחשת בדרך כלל כאשר יותר מ 90-99% מכלל האוכלוסייה איבדה את יכולת הקיום. פנוטיפ זו קשורה לעיתים קרובות עם סטרס חמצוני מוגבר ו / או הגנה ירד בתא. לדוגמה, תדירות פנוטיפ זה יותר מאשר מכפיל בתאים חסר superoxide dismutase cytosolic ו מקטינה באופן משמעותי על חיים ארוכים מוטנטים (למשל, או ras2 sch9 Δ Δ) או superoxide מוטנטים overexpressing dismutases ^22. למעשה, אנו מגדירים לצמיחה מחודשת כמו גידול הכדאיות או התייצבות הכדאיות עבור 3 דגימות רצופות בשלב תמותה גבוה במהלך ההזדקנות הכרונולוגי.

גיל תלויי תדרים של מוטציות DNA שונה להשתנות במידה רבה בהתאם ברקע זן, מניפולציה גנטית, בתנאי תרבות, כמו גם לצמיחה מחודשת / מתנשפת הישרדות נמוכים מאוד. טרום ניסויים אמור להתבצע בנקודות זמן כמו ההישרדות הממוצע ומקסימום עם צפיפות ציפוי שונים עבור מבחני מוטציה כדי לקבוע תדירות טווח מוטציה לפני performingthe חיים מלאים ניתוח בקנה מידה תוחלת. המתח סוג בר תמיד צריך להיות כלול תוחלת חיים או תדירות מוטציה ללמוד במקביל כל טיפול או מוטציה גנטית, כך הניסוי בין-וריאציות ניתן להסביר. העתקים מרובים ביולוגי יש לכלול במחקר וכן, גם נוזלי וגם כדאיות / מוטציה מבחני באתרו צריך להתבצע כדי לאשש את התוצאות.

במקום להתמקד בסוג אחד מסוים של מוטציה בדנ"א, אפיון של חוסר יציבות גנומית תלויי גיל באמצעות מבחני מרובים שילוב, עשוי לשפוך אור על נזק לדנ"א ספציפי נזק לדנ"א תיקון המערכת (ים) אשר תורמים לחוסר יציבות גנומית תלויי גיל. לדוגמה, עלייה משמעותית rearrangements כרומוזומליות הגולמי (GCRs), בהשוואה לאלו של מוטציות DNA אחרות, הוא ציין בשמרים סוג בר מציע לשבור elevationof גדיל כפול ו / או ליקוי בסופו שאינם הומולוגיים שהצטרף (NHEJ) במהלך שמרים הזדקנות כרונולוגי (טבלה 2). ספקטרום מוטציה can1 (רצף של הגן CAN1) שהושגו שמרים wild-type ההזדקנות הציע עלייה נזק חמצוני במהלך ההזדקנות הכרונולוגי מועדת לטעויות תיקון DNA, ואילו, על חיים ארוכים sch9 מוטנטים Δ, נזק לדנ"א חמצוני פחות מופחת בהרבה נוטה שגיאה סינתזה translesion נצפו ^20.

שיטות המתואר כאן ניתן ללמוד עוד הגדילו גיל תלויי חוסר יציבות גנומית. לדוגמה, תאים שקט ולא שקט יכול להיות מבודד נייח שלב תרבויות שמרים באמצעות שיפוע צפיפות השיטה המתוארת על ידי Allen et al. ^23. בשילוב עם מבחני המוטציה המתוארת כאן, יש לנו דיווח כי חלק גדול תלויי גיל מוטציות נובעת תאים שקט, ולא, חלוקת תאים פגומים או אפופטוטיים ^20,24.