מאמר שיטה

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

DOI:

10.3791/3071

⸱

22 ביולי 2011

 ,  , 
1Department of Pediatrics/Allergy, Medical College of Wisconsin , 2Flow Cytometry Core Facility, Medical College of Wisconsin , 3Max McGee National Research Center for Juvenile Diabetes and Human Molecular Genetics Center, Medical College of Wisconsin

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tregs הם מדכאי עוצמה של מערכת החיסון. קיים מחסור של סמנים משטח ייחודי להגדיר אותם, ולכן, הגדרות של Tregs הם פונקציונליים בעיקר. כאן אנו מתארים אופטימיזציה במבחנה מסוגלים לזהות חוסר איזון החיסונית בנושאים בסיכון לפתח T1D assay.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תקינה בתאי T (Tregs) הם מתווכים קריטית של סובלנות החיסונית העצמית אנטיגנים. בנוסף, הם הרגולטורים חיוני של התגובה החיסונית בעקבות זיהום. למרות המאמצים כדי לזהות סמן משטח ייחודי על Tregs, התכונה הייחודית רק הוא יכולתם לדכא את שגשוג ותפקוד של תאים T מפעיל. בעוד שברור כי רק מבחני חוץ גופית ניתן להשתמש בהערכת תפקוד Treg אדם, זה הופך להיות בעייתי כאשר להערכת תוצאות חתך מחקרים שבהם תאים בריאים ותאים שבודדו נבדקים עם מחלות אוטואימוניות (כמו סוכרת מסוג 1-T1D) צורך כדי להשוות. קיימת שונות רבה בין מעבדות במספר וסוג של תאים המגיב T, טבע וכוח של גירוי, Treg: יחסי המגיב לבין מספר וסוג אנטיגן הצגת תאים (APC) בשימוש האדם מבחני חוץ גופית דיכוי. השתנות זו הופכת את ההשוואה בין המחקרים מדידת תפקוד Treg קשה. השדה Treg צריך assay דיכוי סטנדרטית זה יעבוד גם עם שני אנשים בריאים ואנשים עם מחלות אוטואימוניות. פיתחנו ב assay דיכוי במבחנה שמראה מעט מאוד התוך assay משונות גירוי של תאים T מבודד במתנדבים בריאים לעומת נבדקים עם הבסיס הרס אוטואימונית של הלבלב β-תאים. המטרה העיקרית של היצירה הזאת היא לתאר ב assay דיכוי במבחנה אנושי המאפשר השוואה בין קבוצות נושא שונות. בנוסף, assay הזה יש פוטנציאל להתוות הפסד קטן nTreg לתפקד צופים הפסד נוסף בעתיד, ובכך נושאים בזיהוי מי יכול להפיק תועלת מטיפול מניעתי המערכת החיסונית 1. להלן, אנו מספקים תיאור מעמיק של השלבים הכרוכים בהליך זה. אנו מקווים לתרום סטנדרטיזציה של ב assay דיכוי חוץ גופית המשמשת למדידת תפקוד Treg. בנוסף, אנו מציעים זה assay ככלי לזהות מצב של חוסר איזון מוקדם החיסונית סמן פונקציונלי פוטנציאל T1D.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. לפני הקמת assay דיכוי, צריך חרוזים מעיל tosylactivated עם אנטי אנושי CD3 (שיבוט UCHT1, 1μg/ml הריכוז הסופי) לגירוי התא ולאחר מכן לבדוק אם חרוזים הם מצופים ביעילות על ידי הגדרת ב assay שגשוג במבחנה באמצעות אדם T לתאים

  1. קח 1ml של M-450 חרוזים tosylactivated מבקבוקון המקורי, מקום לעמוד מגנטי להחזיק עד שכל החרוזים יש דבק בצד של הצינור. הסר את חיץ תוך הצינור עדיין עומדים המגנטי. קחו את הצינור מתוך עמדה מגנטי להוסיף 1ml של buffer1, במקום את הצינורית לעמוד מגנטי שוב להסיר את buffer1 תוך צינור הוא עומד המגנטי; חרוזים resuspend ב 1ml של buffer1 ולהוסיף 40μl של CD3 אנטי אנושית, להתסיס בשעה 37 ° C במשך 15 דקות, להוסיף 0.1% w / v BSA ולהמשיך התססה במשך 16 השעות הבאות.
  2. לשטוף את החרוזים buffer2 פעמיים במשך 5 דקות ב 2-8 מעלות צלזיוס ופעם buffer3 במשך 5 דקות ב 2-8 מעלות צלסיוס תוך שימוש לעמוד מגנטי כפי שהוסבר לעיל, להסיר את החיץ ואת resuspend את החרוזים 1ml של buffer2; חרוזים הם 8 / ml 4x10 ריכוז סופי ומוכן לשימוש.
  3. Aliquot 50,000 ו 25,000 PBMC / היטב triplicates בצלחת 96-היטב ולהוסיף מספר משתנה של CD3 מצופה חרוזים (4x10 8 חרוזים / ml, CD3 1μg/ml, למשל 1, 2, 3, 4, 5 חרוזים / תא ) על מנת לקבוע את המספר האופטימלי של חרוזים לכל תא. לאחר 72 שעות בתרבית, להוסיף 1μCi [3 ח] thymidine ולהמשיך דוגרים על 37 מעלות צלזיוס במשך 16 השעות הבאות. תאים בצלחת קציר קציר Multiscreen (Millipore), להוסיף נוזל הנצנץ ולקרוא לכל ספירות דקות (CPM) / גם באמצעות למעלה הרוזן NXT (פקארד, CT). השתמש חרוזים / יחס התא כאשר הם מעל לאלף הופעות 5000 אך פחות מ 15,000 כדי למנוע גירוי יתר של Tregs, אשר עלול לאבד את הפונקציה מדכאים. בדרך כלל, יחס של 3 חרוזים / תא מעורר שני המגיב ותאי Treg בכל קבוצות הנושא נבדק עד כה 1-4.

2. PBMC במנותק מן הדם כולו מתורמים בריאים או leukopacks אדם או מעיל באפי (BC) שנלקח בדרך כלל ממקורות מתנדבים בריאים וזמינים ללא תשלום מרכזי עירוי דם מקומי (איור 1)

  1. לדלל את לפנה"ס (~ 50 מ"ל) 01:06 עם PBS (להוסיף 250 מ"ל). עכשיו יש הנפח הכולל 300 מ"ל. לאט לאט שכבת 25ml של BC מדולל על גבי 15 מ"ל Ficoll Paque-PLUS הוסיף 50 מ"ל צינורות פלקון, מבלי להפריע את השכבות. צנטריפוגה ב 800xg (1400rpm בצנטריפוגה Sorvall עם דלי הרוטור מתנדנד SH-3000) במשך 30 דקות ב 4 ° C, עם הבלמים כבוי.
  2. בזהירות לאסוף את שכבת PBMC (שלב ביניים) ולהעביר אותו ל 50 מ"ל צינורות טרי פלקון. לשטוף PBMC ידי מילוי צינורות עד 50 מ"ל עם DPBS. איסוף 2 כדורי תא לתוך צינור אחד. צנטריפוגה ב 400xg במשך 10 דקות ב 4 ° C. חזור כביסה צעד פעמיים, בכל פעם שילוב 2 כדורי תא לתוך צינור אחד. מערבבים את כל כדורי תא לתוך שפופרת 50 מ"ל אחד.
  3. הרוזן PBMC באמצעות Trypan מבחן כחול הדרה. ביצוע דילול 1:10 ב Trypan כחול על ידי הוספת 20μl של PBMC כדי 180μl של Trypan כתם כחול. מערבבים היטב ולקחת 20μl לספור hemacytometer מיד. ספירת המספרים של כל התאים מוכתמת בלא כתם כחול רק ממוקם שני רחובות כל ריבוע ובו 16 ריבועים קטנים יותר. קח את הממוצע של שני המספרים ולהתרבות על ידי 10. מחלקים את המספר הזה על ידי 100 כדי לקבל את מספר PBMC / ml. אחוז תאים לחשב כמו קיימא [1 - (מספר התאים כחול / מספר התאים הכולל) x100]. אם המשך הכדאיות היא ≥ 95%.

3. MACS מראש מסוג CD4 ותאי T

  1. לפני שנמשיך, העברת 1ml של PBMC לתוך צינור חדש, להוסיף 4ml התקשורת להכין תאים עם הקרנה 5000rad, אלה יהיו אנטיגן הצגת תאים (APC).
  2. צנטריפוגה שאר התאים בכל 250xg במאגר PBS/2mM BSA EDTA/0.5% עבור 10min ב 4 ° C. יוצקים את התאים supernatant ו resuspend ב 4ml של חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5%.
  3. הוסף 200μl של microbeads MACS אנטי CD4 ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
  4. שטפי ידי הוספת 40ml של חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5% ו צנטריפוגות ב 250xg עבור 10min ב 4 ° C. יוצקים את supernatant ו resuspend ב 8ml של הטמפרטורה degassed, חדר חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5%.
  5. מסנן להפריד את ההשעיה התא באמצעות טרום הפרדה מסננים אותם לפני העמסה על עמודה LS.
  6. פיצול ההשעיה התא 4ml שכבה כל עמודה LS מכויל על (עם 3ml של deggassed חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5%). טור קבוע ב LS מפריד MidiMACS. לפני ההשעיה תא שנגמר, או להפעיל מחדש flowthrough או להוסיף 3ml של בטמפרטורת החדר deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% חיץ BSA ולתת למאגר לרוץ דרך. הוסף חוצץ יותר עד שזה מגיע ברורה החוצה.
  7. חיץ פיפטה 5 מ"ל deggassed על הטור LS, להסיר עמודה LS מ מפריד MidiMACS ומקום לתוך צינור איסוף סטרילית חדש 15 מ"ל לתת ~ לרוץ 1.0ml דרך. מכניסים את הבוכנה לתוך עמוד ולאט לאט לדחוף את שארנפח החוצה.
  8. לעשות את אותו הדבר עם שתי עמודות LS לשלב את שני שברים מסוג CD4 +. הוספת עד 50 מ"ל תאים PBS ולספור. התשואה הצפויה היא עד 5x10 8 תאים. צנטריפוגה ב 400xg במשך 10 דקות ותאי resuspend היטב 2ml חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5%.

4. מיון פלורסנט Activated Cell (FACS) בידוד (איור 2)

  1. הפוך את קוקטייל של נוגדנים סמנים CD אל פני השטח סמנים הבאים לתא (לשמור מוגנים מפני אור): 20 μl של אנטי אנושי CD8-FITC (שיבוט RPA-T8), 20 μl של אנטי אנושי CD14-FITC (שיבוט M5E2; קולטן LPS), 20 μl של אנטי אנושי CD32-FITC (שיבוט FLI8.26; FcγR-type II) 6 μl של אנטי אנושי CD116-FITC (שיבוט M5D12: GM-CSFRα שרשרת) וכן, לחילופין, להוסיף אנטי 40μl אדם-CD4-APCCy7 (שיבוט RPA-T4).
  2. קח 5μl מתוך ההשעיה תא 2ml ואת הכתם עם 2μl של קוקטייל כתם, זה צינור לקביעת סף (Fluorochrome מינוס אחד FMO) 5.
  3. הוסף 50 μl של אנטי אנושי CD25-PE (שיבוט M-A251, IL-2Rα) לקוקטייל כתם, ולהוסיף את קוקטייל ההשעיה התא דגירה על 4 מעלות צלזיוס 30 דקות. שטפו תאים PBS חיץ, צנטריפוגות ב 400xg במשך 10 דקות ותאי resuspend לריכוז תאים של 10 7 / מ"ל.
  4. הכן בלא כתם תאים תאים או חרוזים מוכתם fluorochrome יחיד שישמש לשלוט פיצוי מיון התא על FACS אריה (BD Biosciences, סן חוזה, ניו ג'רזי).
  5. רוכשת את התאים בצינור FMO אשר יאפשר למשתמש להגדיר את סף למיון של CD25 תאים + T (איור 2 א). קביעת השער סביב FITC שלילי תאים להוציא FITC חיובי התאים המרכיבים מונוציטים, מקרופאגים וכל CD4 + אחרים שאינם-T לתאים (איור 2b).
  6. בחלקה נפרדת, לצייר השערים-CD25, CD25low ו CD25high T-Tregs התאים (למעלה 1% של תאים המבטאים את המספר הגבוה ביותר של CD25) (איור 2 ג). תת Cell בדרך כלל להראות הטוהר גבוהה (איור 2, 2e ו 2f).
  7. צנטריפוגה צינורות אוסף עם תאים ב 400xg במשך 10 דקות ולשמור אותם על הקרח עד ציפוי.

5. הגדרת התרבות תאים בצלחת 96-היטב (ערכת המצורף טבלה 1) ב 200μl/well

  1. 50μl Aliquot של CD3 מצופה חרוזים (1 מיקרוגרם / מ"ל) מחושב להיות 3 חרוזים / תא המגיב היטב, resuspended בתקשורת להשלים עם 10% נקווה האדם א.ב. בסרום בתחתית U-96-גם הצלחות. (לדוגמה, כדי להפוך את התקשורת עם 2ml CD3 מצופה, לקחת 7.5μl ממלאי של CD3 חרוזים מצופים הגמר 4x10 ריכוז 8 / מ"ל ו לדלל ב 2ml של התקשורת; 50μl כל יכיל 75,000 beads-3beads/cell).
  2. מדולל APC מוקרן ריכוז 5x10 תא 5 / ml ולהוסיף 50μl (יכיל 2.5 x 10 4 תאים) לתוך הבאר עם כל גירוי נוסף בעבר, כולל בארות שכותרתו "Tregs בלבד", "APC רק" ו "התקשורת רק" בטבלה 1.
  3. הוסף 2.5 x 10 4 / טוב CD4CD25 או CD4CD25low בתאי T ב triplicates הבאים עיצוב בטבלה 1.
  4. הוסף Tregs לשתף תרבויות (שורה ב 'טבלה 1) ביחס 1:10 (2500 תאים Treg) ו לבארות שכותרתו "Tregs רק" ו דגירה את הצלחת ב 37 ° C ב-CO 2 באינקובטור עם 5% CO 2 , רווי בלחות למשך 72 שעות.
  5. דופק בארות עם 1μCi [3 ח] thymidine ולהמשיך הדגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 16 השעות הקרובות.

6. קציר ועוד היד נטויה

  1. קציר תאים על הצלחת הקציר multiscreen באמצעות Packard filtermate מקצרה או מערכת חלופית.
  2. הוסף נוזל הנצנץ (Microscint 20), מכסים קצירת צלחת עם מכסה פלסטיק שקוף כהכנה לשלב הסופי.
  3. קריאה לכל ספירות דקות (CPM) / גם באמצעות למעלה הרוזן NXT (פקארד, CT) או מערכת חלופית.

7. מחשוב אחוז דיכוי

  1. כאשר התאים בתרבית triplicates, הממוצע מחושב עבור כל תנאי. אם מקדם השונות הוא> 30%, outlier מסולקת ו לדקה רק שתי בארות הם ממוצעים. אחוז דיכוי מתקבל על ידי מחשוב [(sc) / s] x 100%, כאשר s = לדקה בתרבות אחת c = לדקה בתרבות המשותפת.
  2. כפי נאיבי (CD25-) ו - in vivo מופעל (CD25low) ותאי T מפעיל הם מצופה כמו תאים המגיב T, ההבדל ביכולת של Tregs לדכא כל תת אלו שנתפסו בשימוש כמדד מנבא פוטנציאל תפקודי מבוסס על ההנחה כי תאי מופעל קשה יותר לדכא.

8. נציג תוצאות:

השונות הגדולה בשיטות המשמש והתוצאות הנגזרות ב assay דיכוי במבחנה האדם מתבקש לנו לבצע מחקר מקיף על התנאים המשפיעים על assay 1. פיתחנו assay כי בדיקות לא רק פונקציה Treg, אלא גם הטוהר שלהם, בהתחשב יחס נמוך בין Tregs: Teffs (01:10), אשר קבענו קודם 6. בנוסף, Tregs שונים הeir היכולת לדכא בהצלחה נאיבית in vivo המופעל בתאי T גם בנבדקים בריאים, כפי שמוצג באיור 3 ו במחקרים קודמים שלנו 2,4, אשר הופך בולט יותר, אם האיזון החיסונית נפגעת, כמו נושאים בסיכון לפתח T1D . Assay עבדו היטב במחקר שבו אנו מדכאים לעומת פונקציה של טבע (nTregs), ועין מתנהלת (iTregs) והן nTregs במבחנה מורחב, המאפשר לנו להשוות בין תפקידם לשלוט בריא, לאחרונה התפרצות (RO) T1D ו ארוכת שנים (LS ) נושאים T1D. הגענו למסקנה נושאים T1D RO לו יכולת טובה יותר לייצר תפקודית בשתי iTregs ו nTregs התרחב בהשוואה לנושאים LS לשלוט T1D ובריא 7. לפיכך, assay זה יכול לשמש ככלי מעולה הכרה של מדינה בשלבים מוקדמים ומאוחרים של חוסר איזון מערכת החיסון.

1 תוכנית סכמטי מצגת הצעדים מעורב ב assay דיכוי חוץ גופית

figure-protocol-1
באיור 1. צעדים של דיכוי ב assay במבחנה הציג עם תמונות

figure-protocol-2
איור 2. אסטרטגיה gating בבידוד תא FACS. סף) CD25 + הותאם על פי Fluorochrome מינוס אחת (FMO), ב) תאים היו סגורות כמו FITC שלילית, ג) FITC שלילי התאים היו מגודרת נוספים שנאספו CD + CD25-, CD + CD25low ו CD + CD25high ( Tregs) מוצג עם האחוזים, ד) FACS מיון Tregs לאחר מיון, ה) FACS מיון CD + CD25low לאחר מיון, ו) FACS CD4 + CD25 מיון-T לתאים לאחר מיון

figure-protocol-3
איור 3. תוצאות נציג של נבדקים בריאים) תוצאות נציג ספירות לדקה (CPM) של נבדקים בריאים כפי שהוצגו תרבויות יחיד עבור כל תת תא מעורב (נאיבי-CD25-, in vivo הופעל-CD25low, אנטיגן הצגת תאים ו-APC T רגולטוריים תאים-Treg), כמו גם שיתוף ותרביות של תאים המגיב T (CD25 או CD25low) ו Tregs. ב) אחוז דיכוי כל CD25 ו CD25low המגיב בתאי T על ידי Tregs עצמיים מוצג עבור קבוצת הבקרה בריאים (n = 4). דיכוי היה כפי שחושב [(sc) / s] x 100%, כאשר s = לדקה בתרבות אחת c = לדקה בתרבות המשותפת. למרות הבדל קטן קיבולת של Tregs לדכא המגיב בתאי T היה שם לב, זה לא היה משמעותי (לזווג מבחן t p = 0.08). ג) הוצג הן של עותקים לדקה בכל הנושאים סיכון תרבות כל אחת, כולל CD25 ו CD25low כמו המגיב בתאי T, וכן APC ו Tregs, ושיתוף תרבויות שבו כל תת T המגיב תא זרע עם אחוז (CD25-/Tregs ו CD25low/Tregs). ד) Tregs של דיכוי של כל CD25 ו CD25low תאים המגיב T על ידי עצמיים Tregs מוצג בכל הנושאים סיכון (n = 4). ההבדל ביכולת של Tregs לדכא CD25-מול CD25low המגיב בתאי T היה משמעותי (לזווג מבחן t p = 0.04).

טבלה 1. סכמטי להגדיר ב assay של דיכוי חוץ גופית

1-3 4-6 7-9 10-12
CD4CD25- CD4CD25low התקשורת רק התקשורת רק
ב CD4CD25-/ Tregs CD4CD25low / Tregs Tregs בלבד APC בלבד
ג
D
E
F
G
H

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי תכונה ייחודית רק Tregs, פונקציה מדכאים יש לבדוק באופן מהימן ואחיד בין הנושאים בשלבים שונים של התפתחות המחלה בתוך אותו בין מחקרים שונים. אנו מציעים פרטי assay דיכוי שפותחו במעבדה שלנו תרומתנו סטנדרטיזציה של assay זה. במחקר אופטימיזציה הנרחב שלנו, יש לנו קבעו כי גירוי תא T עם אנטי אנושי CD3 מצופה חרוזים (UCHT1 שיבוט, בריכוז של 1μg/ml (להבדיל 5μg/ml זמינים מסחרית) בשילוב עם PBMC כמו APC לספק גירוי טבעי מסוגל להפעיל גם הן תאים T ו המגיב Tregs בנושאים שנבדקו 1. הבחירה של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מקס McGee הלאומית למחקר המרכז לנוער Diabetesat לרפואה של וויסקונסין ומחקר ילדים של המכון ויסקונסין. הממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, או הכנה של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב או מכשיר חברה מספר קטלוגי הערות (אופציונלי)
Ficoll Paque-PLUS Amersham Pharmacia ביוטק 17-1440-03
DPBS-1X Gibco 14190-144
Trypan כחול Invitrogen 15250-061
אנטי CD4 microbeads Miltenyi 130-045-101
טרום הפרדה מסננים Miltenyi 130-041-407
LS עמודה Miltenyi 130-042-401
EDTA Invitrogen 15575-020
BSA סיגמא אולדריץ B4287
אנטי אנושי CD4-APCCy7 (שיבוט RPA-T4) BD Pharmingen 557852
Anti-CD25 אדם-PE (שיבוט M-A251, IL-2Rα) BD Pharmingen 555432
אנטי אנושי CD8-FITC (שיבוט RPA-T8) BD Pharmingen 555366
Anti-CD14-FITC אדם (שיבוט M5E2; קולטן LPS) BD Pharmingen 555397
Anti-CD32-FITC אדם (שיבוט FLI8.26; FcγR-type II) BD Pharmingen 555448
אנטי אנושי CD116-FITC (שיבוט M5D12: GM-CSFRα שרשרת) BD Pharmingen 554532
Dynalbeads M-450 tosylactivated Invitrogen 140-13
Anti-CD3 אדם Ancell 144-024
Buffer1 תוצרת בית 0.1M Na 2 B 4 O 7 pH7.6
Buffer2 תוצרת בית PBS/2mM BSA EDTA / 0.1% pH7.4
Buffer3 תוצרת בית 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5
השלם RPMI התקשורת תוצרת בית RPMI 1640 התקשורת 2-L-גלוטמין mM 5 מ"מ HEPES 100 U / מיקרוגרם / מ"ל ​​peni / strept 0.5 נתרן pyruvate mM
[3 ח] thymidine פרקין אלמר NET027Z005MC
אדם ונקווה א.ב. בסרום אטלנטה הביולוגיים S40110
קציר Multiscreen צלחת Millipore MAHFC1H60
Microscint 20 פרקין אלמר 6013621

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
  2. Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
  3. Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
  4. Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
  5. Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
  6. Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
  7. Major, J. L., Meade, T. J. B. ioresponsive Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
  8. Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
  9. Leôn-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
  10. Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
  11. Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
  12. Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
  13. Yoo, B., Pagel, An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
  14. Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
  15. Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
  16. Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
  17. Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
  18. Leôn-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
  19. Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In VitroTregTT CD41

מאמרים קשורים