מאמר שיטה

תא מבוססי סידן Assay עבור בינוני עד הקרנת תפוקה גבוהה של פונקציות TRP באמצעות ערוץ FlexStation 3

DOI:

10.3791/3149

⸱

17 באוגוסט 2011

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology and Pharmacology, The University of Texas Health Science Center at Houston

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וידאו זה מספק פרוטוקול מפורט לחקר פרופיל פרמקולוגי של TRPA1 ערוצי אנושי באמצעות FlexStation 3. פרוטוקול מכסה הפרטים של הכנת התאים, טוען לצבוע ותפעול של הקורא microplate, FlexStation 3.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FlexStation Devices "מולקולרית 3 הוא קורא benchtop מצב מרובה microplate מסוגל מדידת הקרינה אוטומטיות רב גם הצלחות. הוא אידיאלי עבור בינוני עד תפוקה גבוהה מסכי במסגרות אקדמיות. יש לו נוזל משולב העברת מודול מצויד pipetter מרובת ערוצים והמכשיר קורא עמודה אחת בכל פעם, כדי לעקוב אחר שינויים הקרינה של מגוון רחב של ריאגנטים ניאון. לדוגמה, FlexStation 3 נעשה שימוש כדי ללמוד את הפונקציה של Ca 2 +-חדיר תעלות יונים ו-G-חלבון קולטנים מצמידים על ידי מדידת שינויים תאיים חינם Ca 2 + רמות. חלוף פוטנציאל קולטן (TRP) הערוצים הם משפחה גדולה של ערוצים קטיון nonselective כי תפקיד חשוב פונקציות פיזיולוגיים pathophysiological רבים. רוב ערוצי TRP הם סידן חדיר ולגרום זרימת סידן על ההפעלה. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את היישום של FlexStation 3 ללמוד את פרופיל פרמקולוגי של ערוץ TRPA1, חיישן מולקולרית עבור גירויים רעילים רבים. HEK293 תאים transiently או ביציבות מביע האדם TRPA1 ערוצים, גדל צלחות 96-היטב, עמוסים Ca 2 + רגיש צבע פלואורסצנטי, Fluo-4, בזמן אמת שינויים הקרינה בתאים אלה נמדדים לפני ובמהלך יישום אגוניסט TRPA1 באמצעות מצב FLEX של FlexStation 3. ההשפעה של אנטגוניסט TRPA1 המשוערת נבדקה גם. הנתונים מועברים ישירות מתוך התוכנה SoftMax Pro לבנות ריכוז בתגובה יחסים של TRPA1 activators ומעכבי.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תא ההכנות 96-היטב צלחות

עבור HEK293 תאים trasfected transiently עם TRPA1 האדם cDNA

  1. HEK293 התאים גדלים על 1-2 ימים בינונית Essential מינימלי של Dulbecco (DMEM) המכיל 4.5 מ"ג / מ"ל ​​גלוקוז (Thermo Scientific, SH3002201), בתוספת חום מומת 10% בסרום שור העובר (Invitrogen, 16000-044), 50 יחידות / ml פניצילין 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין (Invitrogen, 15140-163). ביום transfection, את צפיפות התאים צריך להגיע 70-90%.
  2. 96-Coat גם צלחות ידי pipetting 50 μl poly-L-ornithine (סיגמה P3655, 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​מים מזוקקים סטריליים) זה טוב דוגרים על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות. יש לשטוף היטב כל פעם עם פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוחים (DPBS) ללא Mg 2 + ו - Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). צלחת עשויה להשאיר את מכסה המנוע לתא תרבות למשך כמה שעות.
  3. גם עבור כל צלחת 96-היטב, לדלל בצינור Eppendorf 1.5-ml 0.2 מיקרוגרם cDNA של 25 μl OPTI-ממ (Invitrogen, 31985-070). בהיקף של עד פרופורציונלי לפי מספר בארות להיות transfected ידי cDNA אותו. כמו כן לדלל ב Lipofectamine נפרד 1.5-מ"ל צינור Eppendorf 0.4 μl 2000 (Invitrogen, 11668-019) ב 25 μl OPTI-ממ לכל טוב להיות transfected. סולם זה מעלה על פי המספר הכולל של הבארות להיות transfected.
  4. בקצרה המערבולת 2000 cDNA ו Lipofectamine בדילול ולתת להם לשבת בטמפרטורת החדר במשך כ - 5 דקות.
  5. העברת נפח שווה של Lipofectamine בדילול 2000 על צינור המכיל המערבולת בדילול cDNA, ולתת התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות עד 2 שעות. במהלך הזמן הזה, להעביר את cDNA / Lipofectamine 2000 תערובת ב μl 49 / היטב צלחת פולי-L-ornithine המצופה.
  6. Trypsinize HEK293 תאים (שלב 1.1), לספור צפיפות התאים באמצעות hemocytometer או דלפק הרוזנת תא אוטומטי (Invitrogen, C10227), ולהעביר כמות רצויה של תאים (בדרך כלל כ ~ 125,000-150,000 תאים / טוב) ל -15 מ"ל סטרילי חרוטי התחתונה צינור צנטריפוגות. צנטריפוגה ב RPM x 1000 עבור 5 דקות. תאים Resuspend ב ~ 1,250,00-1,500,000 תאים / מ"ל ​​במדיום תרבות DMEM, בתוספת סרום חום מומת 10% שור עוברית, אך ללא אנטיביוטיקה.
  7. לוותר על 98 ההשעיה תא μl היטב כל המכיל את cDNA-Lipofectamine 2000 תערובת באמצעות pipetter רב או Dispenser microplate MicroFill (Bio-Tek). בואו הצלחת לשבת למכסה המנוע דקות לפחות 30 לפני הצבתו לתרבות humidified תא חממה. לדגור על 37 ° C CO, 5% 2 עבור 20-44 שעות.

עבור HEK293 התאים ביציבות להביע TRPA1

  1. עקוב אחר שלב 1.2-96-גם צלחות מעיל.
  2. ועין מתנהלת בקו HEK293-hTRPA1 תא סופק בנדיבות על ידי ד"ר א Patapoutian (מכון המחקר סקריפס) ומתוחזק במדיום זהה wild-type HEK293 תאים (שלב 1.1) אך בתוספת 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​blasticidin (Invitrogen, A1113902) ו - 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​hygromycin B (Invitrogen, 10,687,010). כאשר צפיפות התאים מגיע לכ -90%, trypsinize תאים, לספור צפיפות התאים, וכן את כמות הצנטריפוגות הרצוי של תאים ב 1000 x RPM עבור 5 דקות. תאים Resuspend בצפיפות של כ 1,000,000 תאים / מ"ל ​​במדיום תרבות זהה בתוספת דוקסיציקלין (פישר, BP26535, 0.25 מיקרוגרם / מ"ל).
  3. לוותר על השעיית תא פולי-L-ornithine צלחות מצופה ב 100 μl / גם באמצעות pipetter רב או MicroFill (Bio-Tek). בואו הצלחת לשבת למכסה המנוע דקות לפחות 30 לפני הצבתו לתרבות humidified תא חממה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 16-24 שעות.

2. פתרונות

  1. שנאגרו של האנק תמיסת מלח (HBSS) משמש כפתרון תאיים. הוא מכיל (מ"מ): 137 NaCl, KCl 5.4, 0.25 Na 2 HPO 4, 0.44
    KH 2 PO 4, 1.3 CaCl 2, 1.0 MgSO 4, 1.0 MgCl 2, 10 גלוקוז, 10 HEPES, עם pH 7.4 המותאמת באמצעות 1N NaOH).
  2. Fluo-4 חיץ assay מכיל 2 מ"מ פרובנציד ב HBSS. הפוך את 250 המניות mM פרובנציד (Sigma, P8761) ב 0.5 N NaOH. מדולל ל HBSS ביחס של 1:125. להסתגל ל-pH 7.4 באמצעות 1 N HCl.

3. Cell-טעינה עם Fluo 04:00

  1. ממיסים 1 מ"ג Fluo, 04:00 (Invitrogen, F14202) ב DMSO 912 anhydrous μl לעשות פתרון מניות של 1 מ"מ. Fluo, 04:00 פתרון המניות יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C למשך חודש אחד לפחות.
  2. מערבבים 10 mM μl 1 Fluo-04:00 עם Pluronic 10 μl-F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (w / v) פתרון DMSO) ולאחר מכן להעביר את התוכן כולו חוצץ 5 מ"ל-4 Fluo assay (שלב 2.2) בתוספת 0.1% אלבומין בסרום שור (Sigma, A9418).
  3. שטפו תאים שגודלו 96-היטב צלחות (שלב 1.7 או 1.10) עם HBSS ב 80 μl / גם 2 פעמים באמצעות מכונת microplate (כגון ELx405TM מ Bio-Tek).
  4. מוסיפים את Fluo-4 AM טעינה פתרון (שלב 3.2) בשעה 50 μl / גם באמצעות pipetter רב או MicroFill (Bio-Tek) ו דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  5. שטפו תאים 3 פעמים עם חיץ Fluo-4 assay (שלב 2.2). באמצעות מכונת microplate ELx405TM. לאחר לשטוף האחרון, להשאיר 80 ​​μl של למאגר Fluo-4 assay היטב כל אחד.

4. הכנת צלחת מתחם

  1. במהלך תקופת העמסה 1 hr התא, להכין סדרה של דילולים 3x של אגוניסטים (או היריבים) של 3x הריכוזים הסופי הרצוי למאגר Fluo-4 assay.
  2. פיפטה 250-300 μl של פתרונות מתחם בדילול לצלחת תרכובת 96-היטב. סדר לקבל את דילולים סדרתי של המתחם לבין שולטת חיוביות ושליליות המקביל באותה עמודה הצלחת מתחם בכל פעם זה אפשרי כי FlexStation 3 קורא טור אחד בודד בכל פעם.

5. פלייט קריאה FlexStation 3

  1. הפעל את המערכת (FlexStation 3, המחשב, ואת SoftMax Pro 5.2 תוכנה)
  2. שמור את הניסוי עם שם קובץ חדש. בשלב הגדרת, בחרו מצב FLEX והזן את הערכים הבאים:

פרוטוקול מס '1, השפעת אגוניסט
figure-protocol-1

פרוטוקול מס '2, אפקט נוגד
figure-protocol-2

  1. המקום תיבת קצה חדש, צלחת המתחם את הצלחת לקרוא את המגשים המתאים FlexStation 3 ולחץ על "לקרוא" כפתור. FlexStation 3 יקראו עמודה אחת בכל פעם, להוסיף תרכובות בנקודות זמן מתוכנת מראש, בלי להפריע את הקריאה. זה לוקח בערך 3 דקות (5 דקות עבור פרוטוקול # 2) לסיים את הקריאה עמודה אחת והמכשיר ימשיך לקרוא את הטור הבא עם תוספות תרכובת ביצע מתוכנת על ידי המשתמש בשלב 5.2 עד שכל העמודות לקרוא.

6. ניתוח נתונים

  1. נתוני הניסוי עשוי להיות מעובד ישירות באמצעות SoftMax Pro 5.2 תוכנה או להעתיק ולהדביק לתוך כל תוכנית של גיליון אלקטרוני, כגון Microsoft Excel. ריכוז תגובה עקומה של חומצה TRPA1 אגוניסט flufenamic (FFA) נבנה באמצעות שגרת הבאים לפחות, ריבועים הולם. figure-protocol-3 , שבו Y הוא ציין בתגובה, Y max היא התגובה מקסימלי מנורמל, C הוא ריכוז התרופה המתאים, EC 50 הוא הריכוז הזה עורר תגובה חצי מרבית, H ו n הוא מקדם היל לעין. ריכוז עיכוב עיקול על מתחם TRPA1 המשוערת אנטגוניסט מתקבל באמצעות ריכוז קבוע של פ"א (100 מיקרומטר), בהדרגה להגדיל את הריכוז של א 'מתחם ערך 50 IC של המתחם מחושב על ידי לפחות, ריבועים הולם הבאה המשוואה. figure-protocol-4 , שבו Y הוא תגובה נצפתה ו-Y מקסימום הוא מנורמל בתגובה שיא, [הנמלה] הוא מתחם המקביל ריכוז של, IC 50 הוא הריכוז אנטגוניסט שמייצר חצי מקסימלי עיכוב בתגובה-FFA עורר, ו n H הוא היל לכאורה מקדם.

7. נציג תוצאות:

TRPA1 הוא Ca 2 +-חדיר ערוץ קטיון, הפעלת שמוביל זרם סידן כי ניתן לאתר על ידי Ca 2 + רגישים לצבוע, Fluo-4 (1-2). קו תא HEK293-hTRPA1 יציב שימש ללמוד את ריכוז בתגובה יחסים של TRPA1 אגוניסטים ואת היריבים. תאים עמוסות Fluo, 04:00, ממוקם 80 μl של למאגר assay, ולקרוא באמצעות FlexStation 3. לאחר ההקלטה פלואורסצנציה בסיסית עבור 30 שניות, 40 μl של דילול סדרתי של אגוניסט TRPA1, פ"א, כל אחד 3x הריכוז הסופי הרצוי, נוספו התאים דרך pipetter מרובת ערוצים כלולים במסגרת של מודול fluidics של FlexStation 3. השינויים הקרינה היו במעקב במשך נוסף 180 s. השינויים Fluo-4 הקרינה היחסית של כל אחד גם באו לידי ביטוי כמו ΔF = (F - F 0), שבו 0 F ו-F הם ערכי הקרינה בזמן הריבית תחילת הקריאה, בהתאמה. עקבות נציג קורסים הזמן לשינויים הקרינה בתגובה בסדרה של ריכוזים פ"א מוצגות באיור. 1. הערה עבור ארבעה ריכוזים האחרון פ"א, למרות רמות תגובה מקסימלי דומים, קינטיקה ההפעלה בבירור מהר יותר גבוה יותר מאשר בכל הריכוזים נמוכים FFA. לכן, כדי להבדיל את ההבדלים האלה, ריכוז - יחסים התגובה נבנה על ידי מדידת שיעורי הראשונית (שיפוע) של להגדיל את הקרינה על תוספת של ריכוזים שונים של פ"א (איור 2). אפקט מקסימלי halfריכוז ive (EC 50) של פ"א נקבע להיות 55.4 מיקרומטר (n = 3). כדי לבדוק את היריב המשוערת TRPA1, תרכובת, ביצענו ניסוי דומה באמצעות פרוטוקול מס '2 (שלב 2). במקרה זה, סדרה של דילולים של אנטגוניסט נוספו ב 30 שניות (40 μl של 3x ריכוזי הסופית הרצויה) ואת פ"א נוספה מאוחר יותר של 180 (60 μl של 300 מיקרומטר ריכוז סופי של 100 מיקרומטר). מתחם במינון מופחת dependently את התגובה של התאים TRPA1 פ"א עם ריכוז חצי מעכבות מקסימלי (IC 50) של 4.3 מיקרומטר (n = 3) (איור 2).

figure-protocol-5
באיור 1. הריכוז תלויי הפעלת TRPA1 האדם על ידי פ"א. עקבות הן להגדיל FFA-עוררו של הקרינה לאורך זמן (תגובות רק 60 הראשון של מוצגים בצורה טובה יותר להמחיש את קינטיקה מהירה של פ"א, עורר תגובות). לידיעתך, בריכוזים גבוהים עורר פ"א להגדיל פלואורסצנציה עם הרבה יותר מהר מאשר הקינטית בריכוזים נמוכים, למרות רמות הקרינה השיא היו דומות.

figure-protocol-6
איור 2 ריכוז -. קשרי בתגובה לשינוי FFA-Induced מתחם פלואורסצנציה ו-Induced עיכוב התגובה פ"א ב TRPA1 האדם לידי ביטוי ביציבות ב HEK293 תאים. Δ, ריכוז - יחסים התגובה של פ"א נקבע על ידי מדידת שיעורי הראשונית (מדרון) להגביר את הקרינה של נורמליזציה עם תוספת של ריכוזים שונים של פ"א. הו, ריכוז התגובה היחסים של עיכוב בתגובה-FFA עורר סידן על ידי אנטגוניסט TRPA1 המשוערת, תרכובת A.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאיים Ca 2 + משחק תפקידים חשובים בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון שחרור הנוירוטרנסמיטר (3), פוטנציאל פעולה הלב (4), התכווצות תא שריר (5), האות תא התמרה (6-7), ואת מותם של תאים excitotoxic ( 8). מדידת תאיים Ca 2 + רמות מסייעת להבהיר שינויים פונקציונליים של Ca 2 +-חדיר ערוצי בקרום פלזמה או אברונים תאיים ואת התרומה של
Ca 2 + על התהליכים לעיל (13/09). Assay יכול לשמש גם כדי לחקור את הפונקציה של ה-G-חלבון קולטנים יחד, שרבים מהם...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים בני הזוג. ג'ון הנקוק, ריי גריל, אנדרו מוריס אולגה Chumakova על תמיכתם. מערכת 3 FlexStation הוא חלק מתקן הדמיה UTHSC Cytodynamic. אנו מודים גם בני הזוג. Ardem Patapoutian ומיכאל Bandell מן המחקר סקריפס מכון Genomics של מכון המחקר של נוברטיס קרן (GNF) למתן את הקו הסלולרי HEK293-hTRPA1 יציב. המחקר נתמך בחלקו על ידי מענקי NIH (GM081658 כדי MXZ) וטקסס המרכז הרפואי העיכול מחלות מרכז (אל ה"ה) ואת המשימה חבר / TIRR קרן (אל ה"ה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב חברה מספר קטלוגי הערות (אופציונלי)
FlexStation 3 מולקולרית התקנים FLEX3
96-ובכן, Pipet FlexStation טיפים מולקולרית התקנים 9000-0912
96-ובכן פלטות גריינר ביו אחד 655090
96-טוב נקה התחתונה צלחות שטוחות שחקן המשנה 3595
DMEM Invitrogen 12430-104
Opti-ממ Invitrogen 31985-070
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Fluo, 04:00 Invitrogen F14202
PluronicF-127 Invitrogen P3000MP
פולי-L-ornithine סיגמא P36551
פרובנציד סיגמא P8761
שור בסרום אלבומין סיגמא A9418

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, H. Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).
  2. Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels. Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).
  3. Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons. Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).
  4. Mason, S. A., MacLeod, K. T. Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females. Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).
  5. Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline. Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).
  6. Alagarsamy, S., Johnson, K. M. Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS. Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).
  7. Su, L. T. TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain. J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).
  8. Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury. J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).
  9. George, J. Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons. J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).
  10. Price, K. L., Lummis, S. C. FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ - and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems. J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).
  11. Laude, A. J. Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors. Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).
  12. Marincsak, R. The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1. Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).
  13. Xie, X. Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol. 5, 191-203 (2007).
  14. Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).
  15. Boulay, G. Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein. J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).
  16. Nanda, K. Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter. Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TRPA1HEK293Fluo 4TRP

מאמרים קשורים