וידאו זה מספק פרוטוקול מפורט לחקר פרופיל פרמקולוגי של TRPA1 ערוצי אנושי באמצעות FlexStation 3. פרוטוקול מכסה הפרטים של הכנת התאים, טוען לצבוע ותפעול של הקורא microplate, FlexStation 3.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תא מבוססי סידן Assay עבור בינוני עד הקרנת תפוקה גבוהה של פונקציות TRP באמצעות ערוץ FlexStation 3
במאמר זה
סיכום
תקציר
FlexStation Devices "מולקולרית 3 הוא קורא benchtop מצב מרובה microplate מסוגל מדידת הקרינה אוטומטיות רב גם הצלחות. הוא אידיאלי עבור בינוני עד תפוקה גבוהה מסכי במסגרות אקדמיות. יש לו נוזל משולב העברת מודול מצויד pipetter מרובת ערוצים והמכשיר קורא עמודה אחת בכל פעם, כדי לעקוב אחר שינויים הקרינה של מגוון רחב של ריאגנטים ניאון. לדוגמה, FlexStation 3 נעשה שימוש כדי ללמוד את הפונקציה של Ca 2 +-חדיר תעלות יונים ו-G-חלבון קולטנים מצמידים על ידי מדידת שינויים תאיים חינם Ca 2 + רמות. חלוף פוטנציאל קולטן (TRP) הערוצים הם משפחה גדולה של ערוצים קטיון nonselective כי תפקיד חשוב פונקציות פיזיולוגיים pathophysiological רבים. רוב ערוצי TRP הם סידן חדיר ולגרום זרימת סידן על ההפעלה. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את היישום של FlexStation 3 ללמוד את פרופיל פרמקולוגי של ערוץ TRPA1, חיישן מולקולרית עבור גירויים רעילים רבים. HEK293 תאים transiently או ביציבות מביע האדם TRPA1 ערוצים, גדל צלחות 96-היטב, עמוסים Ca 2 + רגיש צבע פלואורסצנטי, Fluo-4, בזמן אמת שינויים הקרינה בתאים אלה נמדדים לפני ובמהלך יישום אגוניסט TRPA1 באמצעות מצב FLEX של FlexStation 3. ההשפעה של אנטגוניסט TRPA1 המשוערת נבדקה גם. הנתונים מועברים ישירות מתוך התוכנה SoftMax Pro לבנות ריכוז בתגובה יחסים של TRPA1 activators ומעכבי.
פרוטוקול
1. תא ההכנות 96-היטב צלחות
עבור HEK293 תאים trasfected transiently עם TRPA1 האדם cDNA
- HEK293 התאים גדלים על 1-2 ימים בינונית Essential מינימלי של Dulbecco (DMEM) המכיל 4.5 מ"ג / מ"ל גלוקוז (Thermo Scientific, SH3002201), בתוספת חום מומת 10% בסרום שור העובר (Invitrogen, 16000-044), 50 יחידות / ml פניצילין 50 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין (Invitrogen, 15140-163). ביום transfection, את צפיפות התאים צריך להגיע 70-90%.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תאיים Ca 2 + משחק תפקידים חשובים בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון שחרור הנוירוטרנסמיטר (3), פוטנציאל פעולה הלב (4), התכווצות תא שריר (5), האות תא התמרה (6-7), ואת מותם של תאים excitotoxic ( 8). מדידת תאיים Ca 2 + רמות מסייעת להבהיר שינויים פונקציונליים של Ca 2 +-חדיר ערוצי בקרום פלזמה או אברונים תאיים ואת התרומה של
Ca 2 + על התהליכים לעיל (13/09). Assay יכול לשמש גם כדי לחקור את הפונקציה של ה-G-חלבון קולטנים יחד, שרבים מהם.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
אנו מודים בני הזוג. ג'ון הנקוק, ריי גריל, אנדרו מוריס אולגה Chumakova על תמיכתם. מערכת 3 FlexStation הוא חלק מתקן הדמיה UTHSC Cytodynamic. אנו מודים גם בני הזוג. Ardem Patapoutian ומיכאל Bandell מן המחקר סקריפס מכון Genomics של מכון המחקר של נוברטיס קרן (GNF) למתן את הקו הסלולרי HEK293-hTRPA1 יציב. המחקר נתמך בחלקו על ידי מענקי NIH (GM081658 כדי MXZ) וטקסס המרכז הרפואי העיכול מחלות מרכז (אל ה"ה) ואת המשימה חבר / TIRR קרן (אל ה"ה).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | הערות (אופציונלי) |
| FlexStation 3 | מולקולרית התקנים | FLEX3 | |
| 96-ובכן, Pipet FlexStation טיפים | מולקולרית התקנים | 9000-0912 | |
| 96-ובכן פלטות | גריינר ביו אחד | 655090 | |
| 96-טוב נקה התחתונה צלחות שטוחות | שחקן המשנה | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-ממ | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo, 04:00 | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| פולי-L-ornithine | סיגמא | P36551 | |
| פרובנציד | סיגמא | P8761 | |
| שור בסרום אלבומין | סיגמא | A9418 |
מקורות
- Hu, H. Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).
- Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels. Nat Chem Biol. 5, 183-19....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
