הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids

21K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/3151

⸱

16 באוגוסט 2011

 ,  , 
1Department of Molecular Biology, Princeton University

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים את תהליך של בידוד הטוהר גבוהה ההרפס DNA nucleocapsid מן התאים הנגועים. ה-DNA הסופי שנתפסו מן הפתרון של ריכוז הטוהר גבוהה, מה שהופך אותו אידיאלי עבור סידור תפוקה גבוהה, איכות גבוהה התגובות PCR, ו transfections לייצר recombinants ויראלי חדש.

תקציר

וירוסים הם טפילים הסלולר מחייבות, ולכן המחקר של ה-DNA שלהם מחייב לבודד חומר ויראלי מן התא המארח מזהמים ו-DNA. יישומים במורד כמה דורשים כמויות גדולות של DNA ויראלי טהור, הניתן על ידי פרוטוקול זה. יישומים אלה כוללים רצף הגנום הויראלי, שם את הסרת DNA המארח הוא חיוני כדי לייעל את התפוקה נתונים עבור רצפים ויראלי, ואת הייצור של זנים חדשים רקומביננטי ויראלי, שבה שותף transfection מטוהרים של ה-DNA הנגיפי פלסמיד ו ליניארי מאפשר רקומבינציה. 1,2, 3

תהליך זה מנצל שילוב של עקירות וצפיפות מבוססי צנטריפוגה כדי לבודד מטוהרים DNA ההרפס ליניארי nucleocapsid מן התאים הנגועים. 4,5 השלבים טיהור ראשוני במטרה לבודד capsids ויראלי מטוהרים, המכילים ולהגן על ה-DNA הנגיפי במהלך עקירות צעדים צנטריפוגה כי להסיר חלבונים ו-DNA התאי. תמוגה של nucleocapsids אז משחרר ה-DNA הנגיפי, ושני האחרונים פנול, כלורופורם צעדים להסיר החלבונים הנותרים. ה-DNA הסופי שנתפסו מפתרון מרוכז מאוד טהור, עם OD 260/280 ממוצע של 1.90. בהתאם לכמות של תאים נגועים בשימוש, טווח התשואות של ה-DNA הנגיפי של 150-800 מיקרוגרם או יותר. טוהר DNA זה עושה את זה יציב במהלך האחסון לטווח ארוך ב 4C. זהו ה-DNA ובכך אידיאלי עבור סידור תפוקה גבוהה, איכות גבוהה התגובות PCR, ו transfections.

לפני תחילת הפרוטוקול, חשוב לדעת את המספר הממוצע של התאים לכל תבשיל (למשל ממוצע של 8 x 10 6 PK-15 תאים בצלחת ומחוברות 15 ס"מ), ואת titer של המניה ויראלי לשמש ( למשל, 1 x 10 8 פלאק יוצרי יחידות מ"ל). אלה נחוצים כדי לחשב את הריבוי המתאים של זיהום (משרד הפנים) עבור הפרוטוקול. 6 למשל, להדביק one 15 ס"מ צלחת של PK-15 תאים עם המניה ויראלי לעיל, משרד הפנים של 5, תשתמש 400 μl של מניות ויראלי לדלל את זה עם 3.6 מ"ל של מדיום (נפח חיסון הכולל של 4 מ"ל עבור one צלחת 15 ס"מ).

הכנות מרובות דנ"א ויראלי ניתן להכין בו זמנית. מספר הכנות סימולטני מוגבל רק על ידי מספר צינורות בידי הרוטור ultracentrifuge (אחד לכל וירוס, ראה שלב 3.9 להלן). כאן אנו מתארים את התהליך כאילו נעשה על וירוס אחד.

פרוטוקול

1. יום ראשון: זיהום ויראלי והכנת Buffers

  1. הכינו מאכלים 50-10 (בקוטר 15 ס"מ) של התרבות תאים ורקמות של זיהום, למשל PK-15 תאים וירוס pseudorabies (PRV) או תאים Vero עבור נגיף הרפס סימפלקס (HSV).
  2. כאשר התאים 95 - ומחוברות 100%, להדביק אותם (משרד הפנים) של 5-10. כדי לעשות זאת, לחסן כל צלחת באמצעות מניות וירוס בהיקף כולל של 4 מ"ל לכל צלחת, ואז דגירה הצלחות במשך שעה 1 ב 37 ° C. צלחות רוק בעדינות כל 15 דקות על מנת להבטיח כי monolayer תא נשארת מצופה באופן מלא על ידי inoculum את הנגיף. בינתיים, לחמם את המדיום לשלב הבא.
  3. לאחר שעה של זיהום, לשאוב inoculum ויראלי מן הלוחות, מוסיפים 15 מ"ל של מדיום חם, דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 12-20 שעות חממה humidified.
  4. הכן מאגרים LCM (ראה לוח 1) ו רוק לילה ב 4 ° C עבור ערבוב יסודי. הכן TNE עבור resuspension של ה-DNA הנגיפי (ראה טבלה 2).

2. היום השני, שלב 1: תמוגה תא ultracentrifugation

  1. ראייה מאשרים כי זיהום של תאים גרמה השפעה cytopathic אחיד (CPE). אפשר זיהום להתקדם עד התאים כולם אספו, אבל לא הרים את הצלחת.
  2. גרדו את התאים הנגועים לתוך המדיום, ולשלב תאים בינוניים לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל. מספר צינורות חרוטי הדרושים צעד זה יהיה תלוי במספר כלים המשמשים זיהום שלב 1.2 לעיל, כגון: one 50 מ"ל צינור חרוטי ניתן להשתמש גלולה מקסימלית של 3 מנות של 15 מ"ל כל אחד בינוני אופציונלי:. שטפו את צלחות עם 10 מ"ל PBS ולשלב עם התאים ובינוניים.
  3. תאים צנטריפוגה בינוני למשך 10 דקות לעבר כוח 2000 centifugal יחסית (RCF) בטמפרטורת החדר, ואז לשאוב supernatant ו resuspend כל גלולה ב 10 מ"ל של PBS. אם גלולה מדלקת נגיפית התפשט לתוך צינורות חרוטי מרובים שלב 2.2, אלה יכולים להיות recombined לתוך הגליל האחד חרוט על שלב זה. חזור צנטריפוגה והשאיפה אופציונלי:. גלולה זה עשוי להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס פרוטוקול המשיכה במועד מאוחר יותר.

3. יום שני, שלב 2: ultracentrifugation

שמרו על תא גלולה ואת מאגרים LCM על הקרח ככל האפשר במהלך השלבים הבאים.

  1. הוסף β-mercaptoethanol כדי גליצרול 0% - חיץ LCM. בגין קירור ultracentrifuge (לצעד 3.9 להלן) על ידי הגדרת אותו 4 ° C ו הפעלת הוואקום.
  2. Resuspend התא גלולה ב 5 מ"ל של גליצרול 0% - חיץ LCM עד שהוא כבר לא גבשושית. אם יש צורך, מערבולת הצינור כדי לשבור את כל תא שלא נמס גלולה.
  3. חלץ על ידי הוספת 1.5 מ"ל פריאון (1,1,2-trichloro-1-,2,2 trifluoroethane) ו vortexing במרץ. מיד צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 2000 RCF בטמפרטורה של 4 ° C. אסוף את השכבה העליונה עם קצה פיפטה רחב נשא (הימנעות ממשק) ומעבירים צינור חדש אופציונלי:. גלולה אם הוא מוצק דביקות, אתה יכול במהירות לשפוך את השכבה העליונה לתוך צינור חדש.
  4. חזור על מיצוי פריאון ו צנטריפוגות שוב.
  5. אסוף את השכבה העליונה (~ 5 מ"ל) ולהעביר צינור polyallomer חדש ultracentrifuge. הוסף β-mercaptoethanol כדי גליצרול השניים הנותרים - מאגרים LCM.
  6. הכן שיפוע בצינור צנטריפוגות polyallomer ידי underlaying תמצית פריאון (השכבה העליונה) עם 3 מ"ל של גליצרול 5% - LCM (השכבה האמצעית), ולאחר מכן underlaying שוב עם 2.5 מ"ל של גליצרול 45% - LCM (השכבה התחתונה). השתמש פיפטה דקה כדי למנוע גלישה של תוכן הצינור.
  7. במידת הצורך, להכין צינור איזון המקבילה באמצעות אותן הפרופורציות של מאגרים LCM.
  8. העברת צינורות לסלים ultracentrifuge. מאזן סלים אל תוך 0.1 גרם אחד של השני, על ידי הוספת בעדינות גליצרול 0% תוספת - חיץ LCM אל השכבה העליונה (~ 50-100 μl בכל פעם).
  9. שימוש ultracentrifuge קר עם דלי הרוטור אופקי או נדנוד, לסובב את דגימות מאוזנת במשך שעה 1 ב 77,000 RCF (למשל 25,000 סל"ד עבור רוטור SW41Ti) בטמפרטורה של 4 ° C.
  10. במהלך ultracentrifugation, להפוך וו זכוכית ללכוד DNA צף בשלב אתנול משקעים (4.6 להלן). החזק את שני הקצוות של pipet כוס פסטר להשעות את החלק האמצעי מעל להבה. כאשר קטע של זכוכית מותכת כמעט, למשוך בעדינות למתוח את הכוס, לכופף אותו בעדינות כדי ליצור וו זווית בחוזקה (<90 מעלות), ולמשוך בחדות לאטום את הסוף. אם קצה הקרס זכוכית פתוח, להחזיק את קצה מעל להבה, כך זכוכית נמס מספיק כדי לסגור אותו.
  11. לאחר ultracentrifugation, אתה צריך לראות דק אטום גלולה עם נקודה כהה באמצע. בזהירות לשאוב את הנוזל מתוך הצינור, כולל טפטופים לאורך הצדדים, אך הימנעות גלולה בחלק התחתון של הצינור.
  12. הוסף 0.5 מ"ל TNE בטמפרטורת החדר.
  13. בואו גלולה לשבת לפחות 10 דקות כדי לאפשר הידרציה של גלולה. Optional: גלולה עשוי גם resuspend ב TNE לילה, אם שמרו על 4 ° C.

4. יום שלישי: "Ghost" DNA רטיבות

  1. לשבור את גלולה ידי pipetting עם קצה פיפטה בקוטר קטן (למשל טיפ פיפטה p200). אל תדאג הגז בשלב זה, כי ה-DNA הנגיפי נכלל עדיין capsids בשלב זה. מוסיפים את ריאגנטים הבא שפופרת המכילה את גלולה ויראלי, בטמפרטורת החדר, כדי להרוס capsids:
    • 4.25 מ"ל TNE
    • 0.25 מ"ל 10% SDS
    • 2 מ"ג proteinase K
    לערבב בעדינות רוק ריאגנטים אלה. לא צריך להיות עלייה קלה צמיגות.

היזהרו הגז מכאן ואילך, כמו למשל להשתמש בקוטר גדול pipettes ואינם המערבולת חומר ויראלי

  1. תמצית חלבונים נגיפיים על ידי הוספת 5 מ"ל של פנול, כלורופורם ומיד מתחילים היפוך או vortexing לשמור על אמולסיה. מערבבים במשך 10 שניות, ואז בצנטריפוגה אמולסיה במשך 5 דקות ב RCF 2000 בטמפרטורת החדר. אסוף את השכבה העליונה עם קצה פיפטה רחב לשעמם, הימנעות ממשק, ולהעביר צינור חדש אופציונלי:. השתמש נעילת שלב ג'ל (PLG) הצינורות בשלב זה, כדי למנוע זיהום מממשק.
  2. חזור על מיצוי פנול, כלורופורם צנטריפוגות שוב.
  3. לאחר החילוץ פנול, כלורופורם השני, לאסוף את השכבה העליונה לתוך שפופרת 30 מ"ל קורקס זכוכית ומקררים את הצינור ב -20 מעלות במשך 10-15 דקות, לדאוג שזה לא להקפיא.
  4. הוסף 10 מ"ל של אתנול קרים כקרח, לכסות את הצינור (למשל על ידי מתיחת חתיכת Parafilm M מעל), וכן להפוך לערבב מיד. Watch עבור ה-DNA של "רוח רפאים" להופיע, אשר מורכב לזרז חבלי דק. הפוך את הצינור בעדינות לתערובת נוספת לגרום DNA דביק משקעים לאשכול יחד.
  5. השתמש וו זכוכית כדי ללכוד את רוח ה-DNA (S). בזהירות למחוק את ה-DNA כדי להסיר את נוזל עודף, ואז למקם את הקרס (טיפ למטה) לתוך צינור 1.5 מ"ל ולאפשר לו להתייבש. הוסף 0.25-0.5 מ"ל של TE לפזר את רוח ה-DNA. אפשר resuspension של ה-DNA כדי להמשיך לפחות שעה אחת. חנות ה-DNA ב 4 ° C. אופציונלי: כדי למקסם את התשואה ה-DNA, לנתק את הקרס זכוכית לתוך צינור 1.5 מ"ל, כך resuspension את שברי זכוכית יכול להמשיך לאורך זמן.

5. נציג תוצאות

עם גבוה מספיק משרד הפנים, התאים צריכים להשיג CPE מלא בתוך זיהום ~ 18 שעות שלאחר (HPI) עבור wild-type זנים PRV, ו ~ 24 HPI עבור wild-type HSV-1 זנים (איור 1). לאחר התא הנגוע גלולה שנקטפו, השלבים פרוטוקול הנותרים ניתן להשלים ביום אחד ארוך או ביצעו במשך יומיים (איור 2).

כאשר מכינים קרסים זכוכית כדי ללכוד את רוח ה-DNA, חשוב להפוך את זווית וו להיות פחות מ 90 מעלות, כדי שאחר כך הוא יכול להשתלב בבסיס צינור 1.5 מ"ל (איור 3). איטום קצה הקרס הזה מונע אובדן DNA בתוך pipet.

רוחות DNA טופס במהלך השלב המשקעים יופיע, חוטים לבנים חבלי (איור 4). אלה המצרפי להיצמד זו לזו ו / או את הקרס זכוכית להשתמש כדי ללכוד את הדנ"א. לפיכך הקרס זכוכית אותו ניתן לאסוף את הנושאים מרובות דנ"א מתוך הפתרון משקעים.

בחר בעמודה בהתבסס על נפח הרצויה: 10 מ"ל 15 מ"ל 20 מ"ל 40 מ"ל
KCl 1M 1.3 מ"ל 1.9 מ"ל 2.5 מ"ל 5 מ"ל
1M טריס (pH 7.4) 300 μl 450 μl 600 μl 1.2 מ"ל
1M MgCl 2 50 μl 75 μl 100 μl 200 μl
0.5 EDTA 10 μl 15 μl 20 μl 40 μl
NP40/IGEPAL 50 μl 75 μl 100 μl 200 μl
β-mercaptoethanol (להוסיף מיד לפני השימוש) 4.3 μl 6.5 μl 8.6 μl 17.2 μl
השתמש הפרופורציות של גליצרול אחוז הרצוי (0, 5 או 45%)
0% גליצרול אף אחד אף אחד אף אחד אף אחד
מים 8.3 מ"ל 12.5 מ"ל 16.7 מ"ל 33.4 מ"ל
5% גליצרול 0.5 מ"ל 0.8 מ"ל 1.0 מ"ל 2.0 מ"ל
מים 7.8 מ"ל 11.7 מ"ל 15.7 מ"ל 31.4 מ"ל
45% glycerol 4.5 מ"ל 6.8 מ"ל 9.0 מ"ל 18.0 מ"ל
מים 3.8 מ"ל 5.7 מ"ל 7.7 מ"ל 15.4 מ"ל

טבלה 1. מתכונים להכנת מאגרים LCM

לקבלת נפח 50 מ"ל
5 מ"ל NaCl 1M
2.5 מ"ל 1M טריס, pH 7.5
1 מ"ל EDTA 0.5
41.5 מ"ל H 2 O

טבלה 2. הכנת TNE (0.1 M NaCl, 50 מ"מ טריס, pH 7.5, 10 mM EDTA)

לקבלת נפח 1 ליטר
0.2 גרם KCl
0.2 גרם KH 2 PO 4
8 גרם NaCl
1.15g Na 2 HPO 4
H 2 O עד 1 ליטר

לוח 3. הכנה של PBS (2.7 mM KCl; 1.5 מ"מ KH 2 PO 4; 137 mM NaCl, 8.1 mM Na 2 HPO 4; pH 7.0)

איור 1
באיור 1. PK15 תאים (א) לפני ההדבקה, (ב) באמצע דרך זיהומים, (ג) את ההשפעה cytopathic (CPE), לאחר ריבוי גבוה של זיהום.

איור 2
איור 2. סקירה כללית של פרוטוקול.

איור 3
איור 3. שלוש דוגמאות מייצגות של זכוכית ווים לאיסוף רוחות ה-DNA הנגיפי.

איור 4
איור 4. למשל נציג של "רוח רפאים" בנוי היטב ורב DNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חלקים של פרוטוקול זה פותחו במקור עבור בידוד הדנ"א הוויראלי BSL4 התנאים, אבל זה מתאים באותה מידה שאינם BSL תנאים. 4 אנו בדרך כלל להשתמש בפרוטוקול זה על מנת לבודד דנ"א של אלפא herpesviruses PRV ו HSV-1, אשר יש הגנום דנ"א מוקף proteinaceous capsid ומוקף במעטפה השומנים. 7,8 אולם סביר להתאמה ישירות אחרות נגיפי DNA גדולות, כולל בטא ו גמא ו herpesviruses adenoviruses. עקירות דומות משמשות לאיתור וירוסים RNA, כמו גם 9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

החוקרים להעריך את תרומתם של גרג סמית', ליסה פומרנץ, מאט ליימן, Marlies אלדריג', הלינה Staniszewska Goraczniak ואנשי המעבדה Enquist בפרוטוקול זה כיוון עדין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב חברה מספר קטלוגי תגובות
פריאון (1,1,2-trichloro-1-,2,2 trifluoroethane) דיג T178-4 בדוק עם המוסד שלך לקבלת הנחיות לסילוק המתאים פריאון המכילים פסולת, או לראות מנדז et al. חלופות פריאון פוטנציאליים. 9
ג'ל שלב הנעילה צינורות, קיבולת 15 מ"ל כבד 5 PRIME 2302850 אופציונלי
Polyallomer צינורות ultracentrifuge Beckman * 331372 * * צינורות בחר מתאים ultracentrifuge שלך, אלה כלולים כדוגמה בלבד
NP-40 / IGEPAL סיגמא I-3021
PK-15 תאים ATCC CCL-33
Vero תאים ATCC CCL-81
PBS HyClone SH30028.03

מקורות

  1. Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations. J Virol. 84, 5303-5313 (2010).
  2. Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications. J Virol. 77, 10106-10112 (2003).
  3. Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes. Nat Commun. 1, 146-146 (2010).
  4. Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector. Science. 203, 541-544 (1979).
  5. Smith, G. A., Enquist, L. W. Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus. J Virol. 73, 6405-6414 (1999).
  6. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
  7. Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).
  8. Roizman, B., Pellett, P. E. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).
  9. Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus. J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).
  10. Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus. J Med Virol. 31, 129-134 (1990).
  11. Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus. PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DNADNADNA
ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.