Photolysis של תרכובות בכלוב מאפשר ייצור של עליות מהירה מקומי בריכוז של חומרים פעילים מבחינה פיזיולוגית שונים. כאן, אנו מראים כיצד ניתן להשיג תיקון-clamp הקלטות בשילוב עם photolysis המחנה בכלוב או בכלוב Ca לחקר התמרה חוש הריח של העכבר ניתק עצב ההרחה חושית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פלאש Photolysis של תרכובות כלואה צילה של עצב סנסורי חוש הריח
במאמר זה
סיכום
תקציר
Photolysis של תרכובות בכלוב מאפשר ייצור של עליות מהירה מקומי בריכוז של חומרים פעילים מבחינה פיזיולוגית שונים 1. תרכובות בכלובים הם מולקולות עשה פעילות פיזיולוגית של כלוב כימי ניתן לשבור על ידי הבזק של אור אולטרה סגול. כאן, אנו מראים כיצד ניתן להשיג תיקון-clamp הקלטות בשילוב עם photolysis של תרכובות בכלוב לחקר התמרה חוש הריח של העכבר ניתק עצב ההרחה חושית. תהליך התמרה חוש הריח (איור 1) מתקיים cilia של נוירונים חושי הריח, שם odorant קשירה לקולטנים מובילה כדי להגדיל את המחנה שנפתח מחזורית נוקלאוטיד-מגודרת (CNG) בערוצים 2. כניסה Ca בערוצים מפעילה CNG Ca המופעל ערוצי Cl. אנחנו מראים איך לנתק את הנוירונים מפני אפיתל ההרחה העכבר 3 ואיך להפעיל ערוצי CNG או CA-מופעל על ידי תעלות Cl photolysis המחנה בכלוב 4 או בכלוב Ca 5 </ Sup>. אנו משתמשים מנורת פלאש 6,7 ליישם גלי אולטרה לאזור ריסי אל uncage cAMP או Ca תוך תיקון-clamp הקלטות ננקטים כדי למדוד את הזרם בתצורה מתח מהדק כל תא 8-11.
פרוטוקול
1. מכשור
- כדי למדוד את התגובה של נוירונים חושיים ריחניים לפוטוליזה של תרכובות כלואות (caged compounds), אנו משתמשים במנורת פלאש בשילוב עם מערכת הקלטה טיפוסית של patch-clamp הכוללת: מגבר patch-clamp, אלקטרודת הקלטה ואלקטרודת ייחוס המחוברות לראש-הבמה (head-stage) של מגבר ה-patch-clamp, דיגיטייזר, מחשב, תוכנה לרכישת נתונים, מיקרו-מניפולטורים, מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנציה, מערכת פרפוזיה, שולחן אנטי-ויברציה וכלוב פראדיי (איור 2).
- כדי ליצור פלאש בעוצמה גבוהה של אור על-סגול (UV), אנו משתמשים במנורת פלאש Xenon (יחידת פלאש Rapp OptoElectronic JML-C2, איור 3A) הפועלת על ידי פריקה של קבל במתח גבוה דרך נורת פלאש בעלת קשת קצרה הממולאת בגז Xenon6-7. ניתן להפעיל את פלאש האור באופן ידני או באמצעות המחשב, תוך שימוש באותה תוכנה השולטת ברכישת הנתונים האלקטרופיזיולוגיים.
- מסנן UV short pass המותאם ליישומי שחרור (uncaging) בטווח של (270-390 nm) מוכנס לחריץ פלט של מנורת הפלאש, ומוליך אור אופטי מסיב קוורץ מחובר למיקרוסקופ (ראו 1.5).
- ניתן לשנות את עוצמת פלאש האור, ולפיכך את מידת הפוטוליזה, על ידי שינוי פרמטרים ספציפיים:
מתח או קיבול6. ואכן, עוצמת האור קשורה לאנרגיה האגורה בקבל ותלויה בערך הקיבול ובמתח על פניו, לפי היחס הסטנדרטי 0.5 CV2. ניתן לבחור את אחד משלושה ערכי קיבול בפאנל הקדמי של מנורת הפלאש שלנו (C1=1000 μF, C2=2000 μF, או C3=3000 μF), ואת המתח ניתן לשנות בין 100 ל-385 Volts (איור 3A), מה שמייצר אנרגיה אגורה בטווח שבין 5 ל-220 J. משך הפלאש משתנה בין 0.5 ל-1 ms ברוחב חצי מקסימלי מלא ותלוי בערך הקיבול שנבחר. לפני בחירה בקיבול שונה או הגדרת המתח לערך נמוך יותר, יש לפרוק את הקבל על ידי בחירה במצב פריקה (discharge mode) בפאנל הקדמי של מנורת הפלאש (איור 3A).
עם זאת, אנרגיית האור אינה פרופורציונלית פשוטה לאנרגיה האגורה עקב סיבות רבות הקשורות לפיזיקה של פריקות גז ולאבידות לא-ליניאריות במעגל ככל שהאנרגיה החשמלית עולה6. כדי למדוד את האנרגיה הקשורה לפלאש אור, ניתן להשתמש במד ג'ול (joulemeter), כגון ה-JM10 המסופק על ידי RappOptoElectronics. שימו לב שהאנרגיה ביציאה של מוליך האור מקוורץ כאשר מסנן ה-UV מותקן היא בטווח של 1-15 mJ לפלאש, כפי שדווח במדריך למשתמש של יחידת הפלאש של Rapp OptoElectronic.
מערך פוטודיודה (איור 3B) מסופק עם יחידת מנורת הפלאש וניתן להשתמש בו כדי להעריך שינויים בעוצמות האור כפונקציה של C ו-V. ואכן, הפלט של הפוטודיודה הוא פרופורציונלי לעוצמת האור. בהתאם להוראות מדריך המשתמש, מוליך האור מחובר לכניסה של מערך הפוטודיודה, בעוד שהפלט מחובר לאוסילוסקופ. איור 3C מראה את מתח הפלט בשיא של הפוטודיודה בתגובה לפלאשי אור עבור שלושת ערכי הקיבול C1, C2, או C3, הזמינים ביחידת מנורת הפלאש שלנו, לעומת המתח המופעל. ערכים אלה ישתנו ככל שנורת הפלאש תתבלה. מומלץ להשתמש באופן קבוע בפוטודיודה כדי לבדוק את הבלאי של נורת הפלאש.
במקום לשנות את הקיבול ו/או המתח בפאנל הקדמי, ניתן להשיג בקרה מדויקת ומהירה יותר של עוצמת האור על ידי הצבת מסנני צפיפות ניטרלית (neutral density filters) בחריץ מסננים שני של מנורת הפלאש (איור 3A). גישה זו מהירה יותר, ובנוסף משך הפלאש, התלוי בערך הקיבול שנבחר, אינו משתנה. עם מסנני צפיפות ניטרלית בטווח של 100% עד 0.1% העברה, ניתן לשנות במהירות את עוצמת הפלאש על פני טווח רחב. - פלאש האור מופנה אל הנוירון, המגודל בצלחות בעלות תחתית זכוכית, דרך מוליך אור אופטי מקוורץ (איור 2). מוליך האור מחובר לאביזר האפי-פלואורסצנציה של המיקרוסקופ ההפוך באמצעות מתאם. קוביית מסננים שונה ללא מסנן עירור מפנה את קרן ה-UV אל הנוירון באמצעות מראה דיכרואית.
- האור ממוקד דרך עדשת שקיעה בשמן (oil immersion) של 100x. השטח המכוסה על ידי הפלאש מוצג על ידי הכנסת מוליך האור למאיר המספק מקור רציף של אור נראה. התמונה (המוצגת בצהוב בווידאו) נצפית במסך דרך מצלמת CCD המחוברת למיקרוסקופ. קווי המתאר של השטח המואר נמתחים על המסך כדי למקם את שטח פלאש ה-UV עבור הניסויים. לפני הפעלת פלאש ה-UV, האזור הציליארי של הנוירון מובא אל השטח שסומן על המסך.
- גודל נקודת אור ה-UV נשלט על ידי הגדלת העדשה, קוטר מוליך האור ומיקומו של מוליך האור בחלק האחורי של המיקרוסקופ. אנו משתמשים בעדשת שקיעה בשמן בהגדלה של 100x. קוטר הנקודה המעגלית נמדד על ידי הפניית האור מהמאיר לעל סלייד מיקרומטר המונח עלבמת המיקרוסקופ. קוטר הנקודה במערך שלנו הוא בערך 16, 33, 50 או 105 μm עבור מוליך אור בעל קוטר של 200, 400, 600 או 1250 μm בהתאמה.
2. הכנת תמיסות
ניתוח
- תמיסת רינגר (Ringer’s solution): 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM גלוקוז, 1 mM נתרבון פירובט (pH 7.4 המותאם עם 1M NaOH).
- תמיסת עצירה (Stop mix solution): תמיסת רינגר עם 0.1 mg/ml BSA, 0.3 mg/ml leupeptin, ו-0.02 mg/ml DNaseI.
- תמיסת רינגר נטולת יונים דו-ערכיים (Zero-divalent Ringer’s solution): 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 10 mM גלוקוז, 1 mM נתרבון פירובט (pH 7.4 עם 1M NaOH). להוספת 200 μM ציסטאין ו-2 U/ml פאפאאין לצורך הפירוק האנזימטי.
הערה: יש לסנן את התמיסות באופן סטרילי לצורך הניתוח.
תמיסות להקלטת Patch-clamp
תמיסות חוץ-תאיות
- תמיסת רינגר חוץ-תאית: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 1 mM sodium pyruvate (pH 7.4 המותאם עם 1M NaOH).
- תמיסת רינגר דלה ב-Ca: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 1 mM sodium pyruvate (pH 7.4 המותאם עם 1M NaOH).
תמיסות תוך-תאיות
יש להכין ולהשתמש תמיד בתמיסות של תרכובות כלובות (caged compounds) בתאורה עמומה כדי למנוע פירוק של התרכובות הכלובות כתוצאה מאור סביבתי. יש להגן על המכלים מפני אור באמצעות נייר אלומיניום.
cAMP כלוא:
- הכינו תמיסה תוך-תאית המכילה 145 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgATP ו-0.1 mM NaGTP (pH 7.4, כוון באמצעות 1M KOH).
- הכינו תמיסת מלאי על ידי המסת cAMP כלוא (BCMCM-cAMP4) ב-DMSO בריכוז של 50 mM. חלקו למנבובות של 5 μl. שמרו עד שנה בטמפרטורה של -20°C.
- המסו מנבובת אחת מתמיסת המלאי של ה-cAMP הכלוא בתוך התמיסה התוך-תאית כדי להגיע לריכוז סופי של 50 μM של cAMP כלוא. ערבבו באמצעות וורטקס.
- חלקו את התמיסה התוך-תאית המכילה cAMP כלוא למנבובות של 1 ml. שמרו עד חודשיים בטמפרטורה של -20°C עד למועד השימוש.
סידן כלוב (Caged Ca):
אנו מכינים תמיסות תוך-תאיות המכילות 3 mM DMNP-EDTA5 בטעינה של 50% עם 1.5 mM Ca.
- הכינו תמיסה תוך-תאית המכילה 140 mM KCl (או CsCl), ו-10 mM HEPES (pH 7.4 המכוונן באמצעות 1M KOH או CsOH).
- פתחו בקבוקון של 5 mg DMNP-EDTA. הוסיפו 52.8 μl של תמיסת סטנדרט של סידן כלורי 0.1 M ו-1 ml של תמיסה תוך-תאית. ערבבו באמצעות וורטקס.
- כדי למנוע שחרור (uncaging) של Ca כלוא על ידי אור סביבתי, העבירו את התמיסה למבחנה המוגנת מאור באמצעות נייר אלומיניום. הוסיפו תמיסה תוך-תאית עד להגעה לנפח סופי של 3.5 ml. ערבבו באמצעות וורטקס. הכינו אליקוטים של כ-1 ml מהתמיסה התוך-תאית של Ca כלוא ואחסנו עד חודשיים ב-20°C- עד למועד השימוש.
הערות: במהלך הניסויים, יש להגן על תמיסות התרכובות הכלואות (caged compound) מפני אור באמצעות נייר אלומיניום ולשמור אותן על קרח. יש לבצע סינון סטרילי לתמיסה התוך-תאית.
3. דיסוציאציה של נוירונים תחושתיים של מערכת הריח בעכבר
הטיפול בבעלי החיים בוצע בהתאם להנחיות האיטלקיות לשימוש בבעלי חיים במעבדה (Decreto Legislativo 27/01/1992, no. 116) ולהנחיות האיחוד האירופי למחקר בבעלי חיים (No. 86/609/EEC).
- הכינו שלוש צלחות בעלות תחתית זכוכית המצופות ב-10 mg/ml concanavalin-A וב-10 mg/ml poly-L-lysine.
- להכנה לנתיחה, הכינו 1 ml של תמיסת Ringer’s ללא יוני דו-ערכיים. מלאו שתי צלחות פטרי בנפח 50 mm מצופות Sylgard בתמיסת Ringer’s והניחו אותן על קרח. קררו גם תערובת של papain-cysteine, 0.5 ml של תמיסת stop mix, ומזרק עם מסנן 0.22 μm המכיל כ-10 ml תמיסת Ringer’s.
- בצעו הקרבה של עכבר על ידי חנק ב-CO2 ולאחר מכן עריפת ראש. הסירו את העור המכסה את הגולגולת, חתכו לאורך קווי הלסת והניחו את הראש בצלחת פטרי מצופה Sylgard.
- הניחו את הצלחת תחת מיקרוסקופ סטריאו. בעזרת סקאלפל, בצעו חיתוך סגיטלי של הראש לאורכה של קו האמצע. הפכו חצי מהראש כך שהצד המדיאלי פונה כלפי מעלה. הסירו בזהירות את המחיצה (septum) כדי לחשוף את המטרינליות/טורבינאט (ראו גם Cygnar et al., 201013).
- בעזרת פינצטה מספר 3 וסקאלפל, הסירו את הטורבינאט המצופים באפיתל הריח. העבירו אותם לצלחת פטרי מצופה Sylgard.
- בעזרת פינצטה superfine מספר 55, הפרידו את חלקי אפיתל הריח מהחלקים המחוברים של הטורבינאט. העבירו אותם למבחנה המכילה 1 ml תמיסת Ringer’s ללא יוני דו-ערכיים. הוסיפו את תערובת ה-papain וה-cysteine. בעזרת מיקרו-מספריים, קצצו את האפיתל והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות. קצצו שוב בעדינות עם מיקרו-מספריים והמתינו 5 דקות נוספות.
- בעזרת פיפטת פסטור שעברה ליטוש בלהבה, העבירו למבחנה המכילה 0.5 ml של תמיסת stop mix.
- צנטריפוגו ב-300 g (1500 RPM) למשך 5 דקות. השליכו את העלייה (supernatant) והוסיפו כ-1 ml של תמיסת Ringer’s מסוננת. בצעו טריטורציה עדינה בעזרת פיפטת פסטור שעברה ליטוש בלהבה.
- הניחו כ-0.3 ml מהתמיסה המכילה את התאים במרכז של שלוש הצלחות בעלות תחתית הזכוכית. אפשרו לתאים לשקוע למשך כשעה ב- +4°C. הוסיפו תמיסת Ringer’s.
4. הקלטה
- הכינו פיפטות patch מקפילרי בורוסיליקט כדי להגיע להתנגדויות של 3-7 MΩ כאשר הן מלאות בתמיסה תוך-תאית.
- הניחו צלחת בעלת תחתית זכוכית המכילה את נוירוני החישה הריחית המפוזלים על במה של מיקרוסקופ הפוך. בצעו פרפוזיה עם תמיסת Ringer.
- הגנו בנייר אלומיניום מפני אור את המזרק המכיל את התמיסה התוך-תאית עם תרכובות caged ושמרו אותו בקירור. עבדו בתאורה עמומה כדי למנוע פירוק של התרכובות ה-caged כתוצאה מאור סביבתי.
- חפשו נוירון חישה ריחית בודד עם ריסונים שלמים בהגדלה של 100x. הזזי את במת המיקרוסקופ כדי למקם את אזור הריסונים בתוך העיגול המצויר על המסך, במטרה לאתר את אזור ה-UV flash שזוהה קודם לכן.
- מלאו פיפטת patch בתמיסה תוך-תאית המכילה את התרכובת ה-caged באמצעות מחט גמישה. הסירו בועות מקצה הפיפטה. הכניסו את הפיפטה למחזיק שעל ה-headstage של מגבר ה-patch-clamp. התקרבו לסומה של הנוירון באמצעות המיקרו-מניפולטור והפעילו יניקה עדינה כדי להשיג gigaohm seal. הגדירו את המתח ל-60- mV והפעילו יניקה נוספת כדי להגיע למצב whole-cell תוך שימוש בטכניקות patch-clamp סטנדרטיות12.
- המתינו לפחות שתי דקות כדי לאפשר דיפוזיה של התרכובת ה-caged אל תוך הריסונים.
- הפעילו במחשב פרוטוקול גרייה (stimulation) והקליטו את התגובה. השתמשו במסנן low-pass ב-1 kHz ובצעו דיגיטציה בתדר דגימה של לפחות 2 kHz.
- פרוטוקול גרייה טיפוסי מקבע את המתח לערך קבוע ומפעיל פולס UV ממנורת פלאש לצורך פוטוליזה של התרכובת ה-caged באזור הריסונים.
5. תוצאות מייצגות:
עליך להיות מסוגל לבצע שחרור מקומי (uncaging) של cAMP כלוא או של Ca כלוא באזור הריסון של נוירון חישן ריח מבודד, ולהקליט את תגובת הזרם בתצורת voltage-clamp של תא שלם (whole-cell).
איור 4 מציג זרם פנימה טיפוסי שעורר הבזק UV הגורם לפוטוליזה של cAMP כלוא, שהוקלט במתח של -60 mV בנוכחות תמיסת Ringer עם ריכוז נמוך של Ca חוץ-תאי. בתנאי זה, זרם הפנימה נובע מכניסת Na דרך תעלות CNG. שלב העלייה של הזרם היה מהיר והותאם לפונקציה מעריכית אחת עם קבוע זמן של 3.4 ms.
איורים 5A-B מראים את התגובות של נוירון חושי ריח אחר בריכוז Ca נמוך ובבתמיסת רינגר עם 1mM Ca. שלב העלייה של הזרם ב-60- mV הפך לאיטי בהרבה ולרב-מופעי (איורים 5 A-B). זאת בשל פעולת ה-Ca החודר לריסות דרך תעלות CNG המפעיל זרם Cl משני10. רכיב זרם הקטיונים המוקדם, הנובע מהפעלת CNG, קטן יותר בתמיסת רינגר עם 1mM Ca מאשר בתמיסה עם Ca נמוך, וזאת בשל חסימה הנגרמת על ידי יוני Ca החודרים, המפחיתים את הזרם הכולל.
דרך נוספת להפחית את העלייה ב-Ca בריסונים היא קיבוע (clamp) של הנוירון ב-+60 mV (איור 5 C-D). שלב העלייה של התגובה עקב שחרור cAMP (uncaging) ב-+60 mV תואר היטב על ידי אקספוננציאל בודד עם קבוע זמן של 6.7 ms, מה שמעיד על נוכחותו של מרכיב זרם אחד בלבד.
על ידי שחרור פוטו-כימי של Ca בתוך השלישיות של נוירון חושי ריח, ניתן למדוד זרם העולה במהירות. זרם זה מובל על ידי יוני Cl. איור 6 A מציג זרמים פנימה ב-50- mV שנוצרו כתוצאה משחרור פוטו-כימי של caged Ca בתגובה להבזקי UV בעוצמות שונות. שלב העלייה של זרמי ה-Cl המופעלים על ידי Ca תואר היטב באמצעות מעריך יחיד עם קבועי זמן הנעים בין 3.8 ל-5 ms (איור 6 B).
איור 1. התמרה של ריח בסיליה של נוירוני חישה של הריח. מולקולות ריח נקשרות לקולטני ריח (OR), מה שמפעיל חלבון G אשר בתורו מפעיל אדניליל סיקלאז (ACIII) הגורם לעלייה תוך-תאית ב-cAMP. ה-cAMP פותח תעלות מופעלות על ידי נוקלאוטיד מחזורי (CNG), המאפשרות כניסה של יוני Na ו-Ca. העלייה התוך-תאית ב-Ca מפעילה תעלות Cl מופעלות Ca. ניתן להחדיר cAMP כלוא (caged) או Ca כלוא לסיליה באמצעות דיפוזיה דרך פיפט פאץ'. הבזק של אור UV גורם לפוטוליזה של התרכובת הכלואה (עובד, באישור, מתוך Pifferi et al. 20062).
איור 2. מערכת רישום patch-clamp ופוטוליזה של פלאש. רכיבי ההסדר כוללים מגבר patch-clamp, מחשב, דיגיטייזר, מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנציה, נורת פלאש Xenon, מצלמת CCD ומסך. קווים כחולים וסגולים מציינים בהתאמה את נתיב האור הנראה וה-UV.
איור 3. נורת פלאש קסנון. (A) מקור אור המשמש לפוטוליזה של תרכובות כלובות. (B) מודול פוטודיודה המשמש להערכת עוצמת הבזק האור. (C) מוליך האור מנורת הפלאש חובּר לכניסה של הפוטודיודה והפלט הוצג על גבי אוסצילוסקופ. אחד משלושת ערכי הקיבול הזמינים (C1, C2 או C3) נבחר במפסק הפאנל הקדמי של נורת הפלאש, והמתח שונה באמצעות סיבוב הכפתור בפאנל הקדמי. מתח הפלט מהפוטודיודה בתגובה לעוצמות הבזק שונות שורטט לעומת המתח המופעל עבור כל ערך קיבול: C1 = 1000 μF, C2 = 2000 μF, או C3 = 3000 μF. נעשה שימוש במוליך אור בקוטר 600 μm.
איור 4. רישום Patch-clamp בתגובה לפוטוליזה של cAMP כלוא בתמיסת Ca חוץ-תאית נמוכה.(A) תגובת זרם של תא שלם (Whole-cell) שגורמה בנוירון חושי ריח מבודד על ידי פוטוליזה של cAMP כלוא הממוקם בריסונים (cilia). הבזק UV שוחרר בזמן המצוין על ידי החץ. פוטנציאל השמירה היה -60 mV. (B) שלב העלייה של הזרם הותאם היטב לפונקציה אקספוננציאלית בודדת (קו מקווקו) עם קבוע זמן של 3.4 ms.
איור 5. תגובות זרם ששוררה על ידי פוטוליזה של cAMP כלוא בתמיסות עם ריכוז סידן נמוך ובתמיסות Ringer. (A) נוירון חושי ריח הושקע בתמיסת Ringer המכילה 1 mM Ca או בתמיסה עם ריכוז סידן נמוך בפוטנציאל החזקה של -60 mV. הבזק UV שוחרר בזמן המצוין על ידי החץ. (B) תגובות זרם ששורטטו על ציר זמן מורחב הראו שלב עלייה רב-פאזי ב-Ringer, בעוד ששלב העלייה התאים היטב לפונקציה מעריכית בודדת (קו מקווקו) עם קבוע זמן של 3.5 ms עבור התגובה שנרשמה בתמיסה עם ריכוז סידן נמוך. (C) תגובות זרם מאותו נוירון המוצג ב-(A) המושקה בתמיסת Ringer בפוטנציאל החזקה של -60 ו-+60 mV. (D) תגובות זרם ששורטטו על ציר זמן מורחב הראו שלב עלייה רב-פאזי ב- -60 mV, בעוד שב- +60 mV שלב העלייה התאים היטב לפונקציה מעריכית בודדת עם קבוע זמן של 6.7 ms (קו מקווקו).
איור 6. תגובות לפוטוליזה של caged Ca. (A) זרמי תא שלם (Whole-cell currents) שהושרו על ידי פוטוליזה של caged Ca ב-50- mV. הבזקי UV שוחררו בנקודת הזמן המסומנת על ידי החץ. עוצמות ההבזקים שונו באמצעות מסנני צפיפות ניטרלית. (B) קנה מידה של זמן מורחב מראה את העלייה המהירה בזרם לאחר שחרור Ca פוטו-כימי. הזרמים הותאמו היטב לפונקציה אקספוננציאלית בודדת (קוים מקווקווים), עם קבועי זמן של 5, 4.8, 3.8 ms. (שוחזר, באישור, מתוך Boccaccio & Menini, 200710).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Photolysis פלאש של תרכובות בכלוב בשילוב עם תיקון-clamp ההקלטות היא טכניקה יעילה כדי להשיג קופץ מהירים מקומיים ריכוז מולקולות פעילות פיזיולוגית הן בתוך והן מחוץ לתאים. מספר סוגים של compounds1 בכלוב היה מסונתז, ואת הטכניקה הזאת ניתן ליישם סוגים שונים של תאים, כולל תאים בתרבית להביע תעלות יונים כי יכול להיות מופעל או מווסתת על ידי photolysis של כמה תרכובות בכלוב זמינים 11.
Photolysis של תרכובות בכלוב דור...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ציוד | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
| מתאם מודול מנורת פלאש כדי מיקרוסקופ | ראפ אופטו | FlashCube 70 | |
| שולחן האוויר | TMC | מיקרו גרם 63-534 | |
| Digitizer | אקסון מכשירים | Digidata 1322A | |
| נתונים רכישת תוכנה | אקסון מכשירים | pClamp 8 | |
| ניתוח נתונים תוכנה | WaveMetrics | איגור | |
| מראה מתאם עבור מודול | ראפ אופטו | M70/100 | |
| מחזיק אלקטרודה | אקסון מכשירים | 1-HL-U | |
| כלוב פאראדיי של | מותאמים ללקוח | ||
| סנן קוביה | אולימפוס | U-MWU | פילטר עירור הוסר |
| מנורת פלאש | ראפ אופטו | JML-C2 | |
| מלקחיים דומון # 55 | העולם מכשירים Precision | 14099 | |
| זכוכית נימי | העולם מכשירים Precision | PG10165-4 | |
| בתחתית צלחת זכוכית | העולם מכשירים Precision | FD35-100 | |
| הפנס | אולימפוס | הדגש 3100 | |
| הפוך מיקרוסקופ | אולימפוס | IX70 | |
| Micromanipulators | Luigs & נוימן | אני SM | |
| Micropipette פולר | Narishige | PP-830 | |
| צג | HesaVision | MTB-01 | |
| הצפיפות מסננים ניטרלי | אומגה אופטי | משתנה | |
| המטרה 100x | Zeiss | Fluar 440285 | או צייס או Olympus |
| המטרה 100x | אולימפוס | UPLFLN 100XOI2 | או צייס או אולימפוס |
| UV מסנן אופטי shortpass | ראפ אופטו | SP400 | |
| Patch-clamp מגבר | אקסון מכשירים | Axopatch 200B | |
| תמונה העצרת דיודה | ראפ אופטו | מחשב כף יד | |
| מדריך קוורץ אור | ראפ אופטו | משתנה | אנו משתמשים בקוטר 600 מיקרומטר |
| חוט כסף | העולם מכשירים Precision | AGT1025 | |
| כסף הקרקע גלולה | וורנר מכשירים | 64-1309 | |
| מנורת קסנון קשת | ראפ אופטו | XBL-JML |
| מגיב | חברה | מספר קטלוגי |
|---|---|---|
| BCMCM-בכלוב cAMP | BioLog | B016 |
| שור בסרום אלבומין (BSA) | סיגמא | A8806 |
| CaCl2 תקן 0.1 פתרון M | Fluka | 21059 |
| Ca Caged: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 |
| ציסטאין | סיגמא | C9768 |
| Concanavalin סוג V (ConA) | סיגמא | C7275 |
| CsCl | סיגמא | C4036 |
| DMSO | סיגמא | D8418 |
| אני DNAse | סיגמא | D4527 |
| EDTA | סיגמא | E9884 |
| EGTA | סיגמא | E4378 |
| גלוקוז | סיגמא | G5767 |
| HEPES | סיגמא | H3375 |
| KCl | סיגמא | P3911 |
| KOH | סיגמא | P1767 |
| Leupeptin | סיגמא | L0649 |
| MgCl2 | Fluka | 63020 |
| Papain | סיגמא | P3125 |
| פולי-L-ליזין | סיגמא | P1274 |
| NaCl | סיגמא | S9888 |
| NaOH | סיגמא | S5881 |
| NaPyruvate | סיגמא | P2256 |
מקורות
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
- Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
- Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
- Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
- Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
- Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
- Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
- Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
