Photolysis של תרכובות בכלוב מאפשר ייצור של עליות מהירה מקומי בריכוז של חומרים פעילים מבחינה פיזיולוגית שונים. כאן, אנו מראים כיצד ניתן להשיג תיקון-clamp הקלטות בשילוב עם photolysis המחנה בכלוב או בכלוב Ca לחקר התמרה חוש הריח של העכבר ניתק עצב ההרחה חושית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פלאש Photolysis של תרכובות כלואה צילה של עצב סנסורי חוש הריח
במאמר זה
סיכום
תקציר
Photolysis של תרכובות בכלוב מאפשר ייצור של עליות מהירה מקומי בריכוז של חומרים פעילים מבחינה פיזיולוגית שונים 1. תרכובות בכלובים הם מולקולות עשה פעילות פיזיולוגית של כלוב כימי ניתן לשבור על ידי הבזק של אור אולטרה סגול. כאן, אנו מראים כיצד ניתן להשיג תיקון-clamp הקלטות בשילוב עם photolysis של תרכובות בכלוב לחקר התמרה חוש הריח של העכבר ניתק עצב ההרחה חושית. תהליך התמרה חוש הריח (איור 1) מתקיים cilia של נוירונים חושי הריח, שם odorant קשירה לקולטנים מובילה כדי להגדיל את המחנה שנפתח מחזורית נוקלאוטיד-מגודרת (CNG) בערוצים 2. כניסה Ca בערוצים מפעילה CNG Ca המופעל ערוצי Cl. אנחנו מראים איך לנתק את הנוירונים מפני אפיתל ההרחה העכבר 3 ואיך להפעיל ערוצי CNG או CA-מופעל על ידי תעלות Cl photolysis המחנה בכלוב 4 או בכלוב Ca 5 </ Sup>. אנו משתמשים מנורת פלאש 6,7 ליישם גלי אולטרה לאזור ריסי אל uncage cAMP או Ca תוך תיקון-clamp הקלטות ננקטים כדי למדוד את הזרם בתצורה מתח מהדק כל תא 8-11.
פרוטוקול
1. מכשור
- כדי למדוד את התגובה של נוירונים חושיים ריחניים לפוטוליזה של תרכובות כלואות (caged compounds), אנו משתמשים במנורת פלאש בשילוב עם מערכת הקלטה טיפוסית של patch-clamp הכוללת: מגבר patch-clamp, אלקטרודת הקלטה ואלקטרודת ייחוס המחוברות לראש-הבמה (head-stage) של מגבר ה-patch-clamp, דיגיטייזר, מחשב, תוכנה לרכישת נתונים, מיקרו-מניפולטורים, מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנציה, מערכת פרפוזיה, שולחן אנטי-ויברציה וכלוב פראדיי (איור 2).
- כדי ליצור פלאש בעוצמה גבוהה של אור על-סגול (UV), אנו משתמשים במנורת פלאש Xenon (יחידת פלאש Rapp OptoElectronic JML-C2, איור 3A) הפועלת על ידי פריקה של קבל במתח גבוה דרך נורת פלאש בעלת קשת קצרה הממולאת בגז Xenon6-7. ניתן....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Photolysis פלאש של תרכובות בכלוב בשילוב עם תיקון-clamp ההקלטות היא טכניקה יעילה כדי להשיג קופץ מהירים מקומיים ריכוז מולקולות פעילות פיזיולוגית הן בתוך והן מחוץ לתאים. מספר סוגים של compounds1 בכלוב היה מסונתז, ואת הטכניקה הזאת ניתן ליישם סוגים שונים של תאים, כולל תאים בתרבית להביע תעלות יונים כי יכול להיות מופעל או מווסתת על ידי photolysis של כמה תרכובות בכלוב זמינים 11.
Photolysis של תרכובות בכלוב דור.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ציוד | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
| מתאם מודול מנורת פלאש כדי מיקרוסקופ | ראפ אופטו | FlashCube 70 | |
| שולחן האוויר | TMC | מיקרו גרם 63-534 | |
| Digitizer | אקסון מכשירים | Digidata 1322A | |
| נתונים רכישת תוכנה | אקסון מכשירים | pClamp 8 | |
| ניתוח נתונים תוכנה | WaveMetrics | איגור | |
| מראה מתאם עבור מודול | ראפ אופטו | M70/100 | |
| מחזיק אלקטרודה | אקסון מכשירים | 1-HL-U | |
| כלוב פאראדיי של | מותאמים ללקוח | ||
| סנן קוביה | אולימפוס | U-MWU | פילטר עירור הוסר |
| מנורת פלאש | ראפ אופטו | JML-C2 | |
| מלקחיים דומון # 55 | העולם מכשירים Precision | 14099 | |
| זכוכית נימי | העולם מכשירים Precision | PG10165-4 | |
| בתחתית צלחת זכוכית | העולם מכשירים Precision | FD35-100 | |
| הפנס | אולימפוס | הדגש 3100 | |
| הפוך מיקרוסקופ | אולימפוס | IX70 | |
| Micromanipulators | Luigs & נוימן | אני SM | |
| Micropipette פולר | Narishige | PP-830 | |
| צג | HesaVision | MTB-01 | |
| הצפיפות מסננים ניטרלי | אומגה אופטי | משתנה | |
| המטרה 100x | Zeiss | Fluar 440285 | או צייס או Olympus |
| המטרה 100x | אולימפוס | UPLFLN 100XOI2 | או צייס או אולימפוס |
| UV מסנן אופטי shortpass | ראפ אופטו | SP400 | |
| Patch-clamp מגבר | אקסון מכשירים | Axopatch 200B | |
| תמונה העצרת דיודה | ראפ אופטו | מחשב כף יד | |
| מדריך קוורץ אור | ראפ אופטו | משתנה | אנו משתמשים בקוטר 600 מיקרומטר |
| חוט כסף | העולם מכשירים Precision | AGT1025 | |
| כסף הקרקע גלולה | וורנר מכשירים | 64-1309 | |
| מנורת קסנון קשת | ראפ אופטו | XBL-JML |
| מגיב | חברה | מספר קטלוגי |
|---|---|---|
| BCMCM-בכלוב cAMP | BioLog | B016 |
| שור בסרום אלבומין (BSA) | סיגמא | A8806 |
| CaCl2 תקן 0.1 פתרון M | Fluka | 21059 |
| Ca Caged: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 |
| ציסטאין | סיגמא | C9768 |
| Concanavalin סוג V (ConA) | סיגמא | C7275 |
| CsCl | סיגמא | C4036 |
| DMSO | סיגמא | D8418 |
| אני DNAse | סיגמא | D4527 |
| EDTA | סיגמא | E9884 |
| EGTA | סיגמא | E4378 |
| גלוקוז | סיגמא | G5767 |
| HEPES | סיגמא | H3375 |
| KCl | סיגמא | P3911 |
| KOH | סיגמא | P1767 |
| Leupeptin | סיגמא | L0649 |
| MgCl2 | Fluka | 63020 |
| Papain | סיגמא | P3125 |
| פולי-L-ליזין | סיגמא | P1274 |
| NaCl | סיגמא | S9888 |
| NaOH | סיגמא | S5881 |
| NaPyruvate | סיגמא | P2256 |
מקורות
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
