דרך אלטרנטיבית של בידוד motoneurons עכבר עובריים מן חוט השדרה מתואר. השיטה לוקחת בחשבון את העובדה לקטינים יכולים לאגד את הזיקה נמוך עצב p75NTR גורם הגדילה לקולטן. זה preplating לקטינים מבוססי מאפשרת טיהור דומה לזה עם נוגדן ספציפי נגד p75NTR.
מאמר שיטה
לקטינים מבוססי בידוד תרבות Motoneurons עכבר עובריים
במאמר זה
סיכום
תקציר
Motoneurons השדרה לפתח לקראת שלבי postmitotic דרך התפתחות מערכת העצבים העוברית המוקדמת, ולאחר מכן לצמוח מתוך דנדריטים ואקסונים. תאים Neuroepithelial של הצינור העצבי המבטאים Nkx6.1 הם תאים מבשר ייחודי motoneurons השדרה 1. למרות motoneurons postmitotic לנוע לעבר עמדתו הסופית שלהם להתארגן עמודות לאורך בדרכי השדרה 2,3. יותר מ -90% מכלל אלה motoneurons הבדיל ואת מיקומו לבטא את גורמי השעתוק איילט 1 / 2. הם innervate את שרירי הגפיים, כמו גם אלה של הגוף ואת האיברים הפנימיים. בין היתר, motoneurons בדרך כלל להביע את הקולטנים זיקה גבוהה עבור גורם נגזר neurotrophic במוח (BDNF) ו Neurotrophin-3 (NT-3), tropomyosin הקשורות קינאז B ו-C (TrkB, TrkC). הם אינם מבטאים את קינאז tropomyosin הקשורות (TrkA) 4. לצד שני קולטנים זיקה גבוהה, motoneurons מבטאים את הזיקה נמוך neurotrophin p75 NTR הקולטן. NTR p75 ניתן לאגד את כל neurotrophins עם זיקה דומה אך נמוך יותר מאשר לכל neurotrophins את הקולטנים זיקה גבוהה היה לאגד את neurotrophins בוגרת. בתוך חוט השדרה העוברי, NTR p75 מבוטא באופן בלעדי על ידי motoneurons השדרה 5. זה נעשה שימוש כדי לפתח טכניקות motoneuron בידוד לטהר את התאים מן הרוב המכריע של התאים סביב 6. Motoneurons בידוד בעזרת נוגדנים ספציפיים (panning) נגד דומיינים תאיים של NTR p75 יש התברר להיות שיטה יקר כמו כמות הנוגדנים משמש עבור ניסוי בודד היא גבוהה בשל גודל של צלחת המשמש פנורמי. חלופה הרבה יותר חסכוני הוא השימוש לקטינים. לקטינים הוכח באופן ספציפי להיקשר NTR p75 גם 7. השיטה הבאה מתארת טכניקה חלופית באמצעות נבט חיטה agglutinin הליך preplating במקום נוגדן p75 NTR. לקטינים מהווה חלופה זולה מאוד נוגדן p75 NTR ואת הציונים טיהור באמצעות לקטינים דומים לזה של נוגדן p75 NTR. Motoneurons מן חוט השדרה העובר יכול להיות מבודד על ידי שיטה זו, לשרוד ולצמוח מתוך neurites.
פרוטוקול
עבור ריאגנטים מיוחד: לראות Tab. 1. כל ריאגנטים אחרים הרשומים הם באיכות תרבות כיתה התא המתקבל סיגמא אולדריץ'.
1. PORN-H/laminin ציפוי של כלים / coverslips
- הכן פתרון עבודה של 0.5 מ"ג / מ"ל Poly-DL-ornithine hydrobromide (פורנו-H) ב 150 pH borate חיץ mM 8.35.
- פתרון המניות של פורנו 50 / 1 חוצץ מ"ג borate מ"ל ניתן להכין מראש ומאוחסנים ב -20 ° C.
- לעקר coverslips זכוכית ידי בוערים באתנול 100% ולתת להם אוויר יבש.
- מכסים את פני השטח עם פתרון פורנו-H מספיק לילה בשעה 4 ° C.
- למחרת לשטוף שלוש פעמים במים מעוקרים אוויר יבש coverslips.
- הכן פתרון עבודה של 2.5 מיקרוגרם / מ"ל laminin HBSS
- Aliquots ניתן לאחסן ב -20 ° C. הפשירי ב 4 ° C מיד לפני השימוש.
- מכסים את פני השטח של פורנו-H מצופה coverslips עם פתרון laminin ולתת להם לדגור במשך שעות לפחות 2 בטמפרטורת החדר עד לשימוש.
2. ציפוי לקטינים הצלחת טיהור
- הכן תמיסה של 10 mM טריס במים מעוקרים, pH 9.5.
- הוסף לקטינים (לפתור את לקטינים (Sigma L9640) אבקת HBSS) לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל.
- מעיל את פני השטח של צלחת 10 ס"מ עם תא תרבות מ"ל 8 של הפתרון לקטינים ולתת לו דגירה של לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את צלחת שלוש פעמים עם HBSS ולאחסן HBSS עד לשימוש.
- הכן KCl 30mm, 0.8% (w / v) NaCl depolarisation-פתרון. לעקר על ידי סינון לאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
3. Motoneuron בינוני תרבות
- סוס הפשירי סרום לילה ב 4 ° C ו להשבית ב 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, Aliquot לתוך 5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C. Aliquot הפשירי ישירות לפני השימוש ב RT.
- חנות B27-תוספת של 1 aliqouts מ"ל ב -20 ° C. הפשירי תוסף B27 ב RT מיד לפני השימוש. הימנע מחזורים להקפיא להפשיר.
- Glutamax Aliquot לתוך 0.5 aliquots מ"ל ולאחסן ב -20 ° C ולהשתמש בו ב 1:100.
- הכן פתרון מניות של 10 מיקרוגרם / מ"ל CNTF במים מעוקרים BSA עם 0.1%. חנות ב -20 ° C.
- מערבבים 46 מ"ל neurobasal בינוני עם 2.5 מ"ל סרום סוס, 1 מ"ל B27-תוספת ו 0.5 מ"ל glutamax ישירות לפני השימוש.
- הוסף CNTF לריכוז סופי של המדיום ng / ml 10 מראש חם בינוני עד 37 ° C.
4. חוט השדרה לנתיחה
- הקורבן עכבר E12.5 בהריון להסיר את העוברים בזהירות. הוסף מספיק RT HBSS כדי לכסות לחלוטין את העוברים.
- הסר את הראש והזנב המקום הצד האחורי עובר עם גפיים רכובה.
- תקן את העובר עם מלקחיים ולהסיר את העור החיצונית עם מלקחיים אחרות.
- הסר את עמוד השדרה על ידי פירסינג מלקחיים תחתיה והרימו אותו במסור כמו תנועות משני צידי עמוד השדרה.
- מעבירים את חוט השדרה מבודד לצלחת חדשה עם HBSS לפתוח את הערוץ המרכזי של חוט השדרה בצד הגבי.
- מוציאים את הגרעינים השורש הגבי על ידי הסרת קרומי המוח מצרף של חוט השדרה.
- איסוף החלקים המותני של מיתרי השדרה של עד 6 עוברים לכל צלחת לקטינים בצינור תגובה Eppendorf מלא 1 HBSS מ"ל ולאחסן על הקרח עד ההכנה נעשית.
5. העשרה של motoneurons ידי טיהור לקטינים מבוססי
הערה: לפני שמתחילים את הצעדים הבאים, האחרונה כאן להכין prewarm הבינוני (ראה שלב 3).
- הכן פתרון טריפסין על ידי פתירת 1 גרם טריפסין ב HBSS 100 מ"ל, חנות ב -20 ° C ו להפשיר ב 4 ° C.
- מערבבים 1g מעכבי טריפסין עם 98 HBSS מ"ל ו 2 מ"ל של 1 M HEPES pH 7.4, 1 aliquots מ"ל צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C.
- מעבירים את הצינור עם מיתרי השדרה כדי ברדס תרבית תאים ובזהירות להסיר 700 μl של HBSS.
- הוסף 7.5 פתרון טריפסין μl ומערבבים על ידי צינור היפוך בזהירות.
- בצע trypsination דקות 8 ב 37 ° C.
- עצור את התגובה על ידי הוספת 30 μl מעכב טריפסין ו פיפטה מעלה ומטה (triturate) בזהירות 10-15 פעמים עם קצה 1000 פיפטה μl עד אגרגטים התא לא יותר גלויים. חזור על טחינה דקה עם פיפטה 20-200 μl וקצה המקביל.
- פיפטה הפתרון הנייד לתוך צלחת HBSS המלא לקטינים ולפזר את התאים על ידי בעדינות לסובב את הצלחת.
- שמור את הצלחת לקטינים עבור 60 דקות ב RT על משטח הרטט חופשי. כיסוי זה, כדי למנוע זיהום.
- הסר את HBSS בעדינות ולשטוף את הצלחת בזהירות 4 פעמים עם טרום חימם HBSS להסיר שברי תאים תאים לא מחובר / פנויות.
- מיד לאחר השלב האחרון כביסה, להוסיף 500 פתרון depolarisation μl הצלחת ולתת לו דגירה עבור 1min.
- להקל על הניתוק של תאים מחויב לקטינים על ידי רעדהקשה על צלחת.
- מלאו את הצלחת עם בינוני 2 טרום חימם מ"ל התרבות להעביר צינור 15 בז מ"ל.
- ספירת מספר התאים עם תא ספירת neubauer.
- פלייט התא על coverslips מצופה או צלחות laminin במספר מתאים בהתאם ליישום.
- ביצוע חילופי בינוני ביום 1 ולאחר מכן בכל היום השני על ידי החלפת זהיר של 50% של המדיום הישן. השתמש תמיד מראש התחמם, המוכן טרי בינוני תרבות חדשה.
6. נציג תוצאות:
Motoneurons עובריים ניתן להשיג מעוברים העכבר E12 ל E14. 2-3% מהאוכלוסייה תא הכולל של עמוד השדרה המותני מורכב motoneurons וכן הנוירונים השורש הגבי ganglionic הם p75 NTR חיובי וכן, חשוב להיפטר של תאים אלה לפני תחילת ההליך לקטינים מבוססי preplating ( לסקירה ראה איור 1 ואיור 2). שנית, קרומי המוח כוללות חלוקת תאים בתוקף כי יש לשלול גם כשהם לא ניתן להסיר כראוי על ידי הליך לקטינים מבוסס preplating (איור 2, איור 3). במקרים גרועים יותר, תאים אלה יכולים לגדול יותר הצלחות תרבות. התמונות נציג איור 3B ו 3D גם רושם על צפיפות התא התחתון לאחר שטיפה נהלים בוצעו (ראה שלב 5.9 של הפרוטוקול). תרבויות של motoneurons עכבר עובריים נשמרות בדרך כלל לתקופה של עד חמישה או שבעה ימים. במהלך פרק זמן זה התאים להקים neurites שלהם עד אורך מרבי (איור 4). אורכי Neurite מאוד תלוי המצע על צלחות 8. המצע הטיפוסי הוא laminin אשר מצופה על פורנו-H מנות תרבות מכוסה. Motoneurons יכול גם לגדול על מצעים אחרים או פחות מוגדר, כמו מטריצות תאיים שנוצר על ידי תמוגה מים 8. במקרים של אורך לא טובים ציפוי, neurite ו חרוט אזור הצמיחה ירד מוות של תאים בדרך כלל עליות. תמיכה Trophic ממלא תפקיד מכריע להישרדות של motoneurons עכבר עובריים בתרבות. ההישרדות של תאים מצופה בתחילה על ירידה seven היום ל -10% עד 20% ללא תמיכה trophic 6. נגזר המוח גורם neurotrophic (BDNF) גורם neurotrophic ריסי (CNTF) הם הגורמים הנפוצים ביותר, אבל אחרים יכולים לקדם את ההישרדות גם [גורם מעכבות לוקמיה (LIF), Cardiotrophin-1 (CT-1), גורם בסיסי הצמיחה פיברובלסטים (bFGF ), אינסולין גורם גדילה דמוי 1 (IGF-1) 9].
1. תרשים זרימה תכנית להכנת motoneurons עכבר עובריים. ציור סכמטי ממחיש את השלבים השונים של בידוד תרבות motoneurons עכבר עובריים. קיצורים: SC: חוט השדרה; HBSS: פתרון הנקס מלח מאוזנת; MN: motoneuron.
איור 2 בידוד בחלק המותני של עמוד השדרה של העכבר E12.5:.. E12.5 העובר העכבר. עבור לשלב הבא, הראש הזנב יוסרו הגוף ממוקם ב-הגבי עמדה: העובר במצב הגבי-up. מלקחיים על ימין ועל שמאל של חוט השדרה מתקנים את הגוף עובר על עמדתה. אחד מלקחיים משמש לאחר מכן לחתוך את העור כדי לחתוך מתחת לחוט השדרה השני משמש כדי לתקן את העובר בעמדה שלו C:. בחוט השדרה מבודד מעובר E12.5 העכבר. החלקים של חוט השדרה (הצווארי, החזי, המותני) מצוינים. חוט השדרה מוקף בקרום המוח וחלק הגרעינים השורש הגבי עדיין מייחסים להם D:. חוט השדרה הוא לחתוך longitudinally בצד הגב כדי לפתוח אותו לכיוון התעלה המרכזית E:. קרומי המוח בצד הגחון כעת נלקח מן חוט השדרה שטוח. הערה: בעוד המריא, החלק המותני מסומן על ידי חתך קטן. פריץ: רק את החלק המותני של עמוד השדרה הוא נלקח לאחר מכן עבור הליכים נוספים.
איור 3 קביעת ובידוד של איילט חיובי תאים בחוט השדרה המותני של E12.5 עוברי עכבר:.. איילט-1 / 2 נוגדן תוויות עמודות motoneuron בתוך חוט השדרה המותני עובריים (אדום, חץ) ותוויות Hoechst כל גרעינים בתוך הקטע. הצלב קטע של חוט השדרה lumar E12.5. E12.5 עוברי עכברים היו טבילה-קבוע paraformaldehyde 4% עבור 6 שעות, שטף 3 פעמים עם פוספט שנאגרו מליחים שטופלו סוכרוז על פי נהלים קבועים. Cryosections של 20 מיקרומטר נלקחו עם cryostat לבין חלקים טופלו עבור מכתים immunhistochemical פי הנהלים תקן 11. כלי חלקים שכותרתו לאחר מכן עבור לוקליזציה של גרעין התא עם Hoechst. שים לבהנוירונים הם השורש הגבי ganglionic Islet-1/2-positive וכן וכי הליך זה אינו כולל הכנה חלקי רקמה ההליך בידוד B:. איילט-1 / 2 שכותרתו (אדום, חץ) תאים ניתק את חוט השדרה המותני מ E12. 5 עוברים, שמאל - ימין לפני - אחרי preplating לקטינים מבוססות. התאים היו counterstained עם Hoechst לדמיין כל גרעיני תאים C:. כימות של תאים Islet-1/2-positive לפני ואחרי preplating לקטינים מבוססי D:. Nkx6.1 motoneurons שכותרתו מ E12.5 עוברים לאחר יום אחד בתרבות. התאים היו counterstained עם Hoechst כדי cisualieze כל הגרעינים. שים לב, 90% של כל התאים הם Nkx6.1 חיובית. קיצורים: SC: חוט השדרה; MN: motoneuron; DRG: גנגליון השורש הגבי.
איור 4 אפיון E12.5 motoneurons העכבר A ו-B:.. מועשר מבודד E12.5 עכבר motoneurons השדרה המותני להביע p75 NTR ב 0 ימים במבחנה (0div) וביום 2 במבחנה (2div). תאים תוקנו עם paraformaldehyde 4% ו מוכתם לאחר מכן עבור NTR p75 על פי נהלים קבועים. תאים היו counterstained באמצעות Hoechst לדמיין את כל הגרעינים C:. Motoneurons מועשר לאחר 5 ימים במבחנה (5div) על פורנו-H ו laminin כמו מצעים תרבות בנוכחות מוכתם CNTF עבור טובולין β-III. שים לב כי התאים גדלו החוצה neurites ארוך ולהציג את המורפולוגיה motoneuron טיפוסי עם אחד יותר (קנים) תהליך אחד או יותר תהליכים קצרים (אקסונים דנדריטים). קיצורים: MN: motoneuron; div: ימים במבחנה.
| לאחר ניתוק ללא preplating לקטינים מבוססי | |||
| המספר הכולל של תאים / SC | Trypan כחול חיובי תאים [%] | Islet-1/2- תאים חיובי [%] | |
| 1 | 995.0 | 13,1 | 9,5 |
| 2 | 889.4 | 8,0 | 10,0 |
| 3 | 1.180.0 | 11,0 | 10,8 |
| ממוצע ± סטיית תקן | 1.021.0 ± 147.1 | 10,7 ± 2,6 | 10,1 ± 0,7 |
| עם preplating לקטינים מבוססי | |||
| מספר תאים אחרי preplating / SC | Trypan כחול חיובי תאים [%] | Islet-1/2- תאים חיובי [%] | |
| 1 | 189.6 | 9,9 | 70,5 |
| 2 | 168.8 | 3,7 | 76,1 |
| 3 | 125.0 | 0,0 | 72,5 |
| ממוצע ± סטיית תקן | 161.1 ± 33.0 | 4,5 ± 5,0 | 73,0 ± 2,8 |
טבלה 1. סיכום תוצאות של נהלים בידוד נציג motoneurons עכבר עובריים משלב E12.5. מ 3 הליכים שונים בידוד במיוחד למטרה זו ניתנות כמספרים מוחלט או מספרים אחוז ± SD. קיצור: SC: חוט השדרה; SD: סטיית התקן.
| איילט-1 / 2 תאים חיוביים עם [%] p75 פנורמי | איילט-1 / 2 תאים חיובי עם לקטינים מבוססי פנורמי [%] |
| 92,0 ± 3,5 1 | 73,0 ± 2,8 |
טבלה 2. תוצאות השוואה בין לקטינים מבוסס p75 מבוססי 1 מספרים תא פנורמי motoneuron. ניתנים כמספרים אחוז ± SD.
דיון
היתרון של טכניקה זו מבוססת לקטינים preplating היא שזה זול יותר מאשר הליך NTR מבוסס p75 פנורמי, ו לקטינים יציב יותר נוגדנים. העשרה המופיעים באיור. 2 ו Tab. 1 מראה כי הנוהל מאפשר טיהור של מספר דומה של תאים כי רוב של תאים אלה מבטאים את הסמן motoneuron איילט-1 / 2. השלב הקריטי ביותר הוא בידוד את ההליך על חוט השדרה המותני. הסרת קרומי המוח ואת DRGs (איור 2) הוא חיוני לתהליך טיהור הבאים על ידי preplating לקטינים מבוססות. אם זה כבר הצליח כראוי, כמעט כל התאים מבטאים את NTR p75 (לתמונה נציג איור. 3a). הסיבה להבדל בין הבעת איילט-1 / 2 ו - p75 NTR הוא קרוב לוודאי כי motoneurons המותני דיפרנציאלי להביע רמות גבוהים או נמוכים יותר של איילט-1 / 2 10. במקרה של רמות נמוכות של ביטוי איילט 1 / 2 זה אולי ברח תשומת הלב שלנו מכתים את immuncytochemical והספירה הבאים כפי שהיינו מחמירים ביחס תאים חיובי לעומת שלילי (Tab. 1). בנוסף, טבלה 1 מראה בבירור כי תאים מבודדים לשרוד את ההליך במצב בריא, כמו שיש רק מעטים trypan כחול התאים החיוביים מצביעים על כך התאים ניזוקו באופן בלתי הפיך. הליך זה alterative גם מאפשר בידוד של motoneurons מעוברים יחיד ולכן המלטות של גנוטיפ מעורבת מעכברים עובריים. לסיכום, זו חלופה להליך פנורמי עם הנוגדן NTR p75 יש 6 דומה אם לא זהה יכולות מבחינת טווחי יישום אפשרי מספק שיטה זולה ויעילה טיהור חלופיות motoneurons עכבר עובריים.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
אנו מודים סנדרה ברגן לקבלת תמיכה טכנית מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי מחלקת המחקר חלבון (PRD, TP A1.2 (RC ו-TS), ואת מחקר RUB Fond, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) נוגדנים חד שבטיים 39.4D5 ו F55A10 התקבלו ללימודי התפתחותית Hybridoma בנק (DSHB, איווה העיר, IA).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide | סיגמא | P8638 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| HBSS | Gibco | 14170 | |
| זכוכית coverslips | Thermo | Ø 10 או 14mm | |
| לקטינים | סיגמא | L5142 | |
| תרבית תאים תבשיל | Nunc | 150350 | Nunclon משטח הדלתא |
| סוס בסרום | Linaris | SHD3250ZK | כל אצווה יש להיבדק על MN תרבות |
| B27 מוסף | Gibco | 17504-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| CNTF | סיגמא | N0513 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-041 | |
| מצבטים | נירוסטה, גודל 4 או 5 | ||
| טריפסין | וורטינגטון | LS003707 | |
| מעכבי טריפסין | סיגמא | T6522 | |
| Anti-איילט-1 | DSHB | 39.4D5 | תרבית תאים supernatant |
| Anti-Nkx6.1 | DSHB | F55A10 | תרבית תאים supernatant |
| Anti-p75 NTR | Abcam | Ab8874 |
טבלה 3. טבלת ריאגנטים ספציפיים וציוד.
מקורות
- Vallstedt, A. Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification. Neuron. 31, 743-755 (2001).
- Tsuchida, T. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79, 957-970 (1994).
- Lin, J. H. Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression. Cell. 95, 393-407 (1998).
- Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons. Acta Neurochir. , 21-35 (2004).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
הדפסות חוזרות והרשאות
