Method Article

ניבוי של שימוש בנגיף HIV-1 Coreceptor (זיקה) על ידי ניתוח רצף באמצעות גישת genotypic

DOI:

10.3791/3264

⸱

December 1st, 2011

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Virology, University of Cologne, 2Max Planck Institute for Informatics, 3Institute for Immune genetics, 4Department of Gastroenterology, Hepatology and Infectiology, University of Duesseldorf, 5Department of Dermatology, University of Essen, 6Department of Internal Medicine, University of Cologne, 7Augustinerinnen Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החיזוי של שימוש coreceptor של HIV-1 נדרש לניהול קבוצה חדשה של תרופות תרופתיות, יריבי coreceptor כלומר. זה יכול להתבצע על ידי ניתוח רצף Env גן ופרשנות לאחר מכן באמצעות מערכת פרשנות מבוססת אינטרנט (geno2pheno [Coreceptor]).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maraviroc (MVC) היא התרופה התרופתית המורשה הראשונה מהכיתה של יריבי coreceptor. הוא נקשר למארח coreceptor CCR5, המשמש את רוב זני HIV כדי להדביק את התאים החיסוניים האנושיים (1 איור). בידודי HIV אחרים משתמשים coreceptor שונה, CXCR4. שהקולטן משמש, נקבע בווירוס על ידי חלבון Env (איור 2). בהתאם coreceptor שימוש, הווירוסים מסווגים כR5 או X4, בהתאמה. MVC נקשר לקולטן CCR5 עיכוב כנסתם של וירוסי R5 לתא המטרה. במהלך המחלה, וירוסי X4 עשויים להתגלות ומתגברים על וירוסי R5. קביעת שימוש coreceptor (המכונה גם זיקה) היא אפוא חובה לפני מתן של MVC, כפי שדרש EMA וה-FDA.

הלימודים ליעילות MVC להניע, כשרון ו1029 בוצעו עם assay Trofile מMonogram, סן פרנסיסקו, ארה"ב זה assay איכות גבוהה המבוססים על sophiבדיקות רקומביננטי sticated. הקבלה לבדיקה זו לשגרת היומיום היא נמוכה למדי מחוץ לארה"ב, שכן רופאים באירופה ולא נוטים לעבוד עם מעבדות מומחים מבוזרות, אשר גם מספקות בדיקות עמידות הנגזרת ממנו. מעבדות אלו עברו כמה הערכות אבטחת איכות, אחרון שהוצגו ב2011 1.

כבר כמה שנים, יש לנו בצענו קביעות כמיהות מבוססות על ניתוח רצף מאזור HIV env-V3 הגן (V3) 2. אזור זה נושא מספיק מידע כדי לבצע חיזוי אמין. נחישות genotypic שימוש coreceptor מציגה יתרונות כגון: זמן קצר מחזור (שווה ערך לבדיקת התנגדות), עלויות נמוכות יותר, אפשרות להתאים את התוצאות לצרכיהם של המטופלים ואפשרות של ניתוח דגימות קליניות עם עומס נגיפי נמוך מאוד או אפילו גילוי (VL ), במיוחד מאז מספר הדגימות נותחו עם VL <1000 עותקים / μlגדל בערך בשנים האחרונות (3 איור).

השלבים העיקריים לבדיקת זיקה (איור 4) הוכיחו בסרט הזה:

1. אוסף של דגימת דם
2. בידודו של הנגיף RNA מפלזמה וה-DNA proviral HIV / או מתאי הדם mononuclear
3. הגברה של אזור env
4. הגברה של אזור V3
5. תגובת רצף של amplicon V3
6. טיהור של דגימות הרצף
7. סידור את הדגימות המטוהרות
8. עריכת רצף
9. סידור נתונים לפרשנות וחיזוי כמיהות

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מסוכם באיור. 4.

1. איסוף דגימות דם

  1. איסוף דם מ"ל לפחות 3 בצינורות EDTA באתר הקליני.
  2. הדוגמות ניתן לאחסן עד שבוע ב 4 ° C.
  3. שלח את דגימות דם EDTA-ההקדם האפשרי למעבדה בדואר רגיל.

2. בידודו של נגיף RNA ו / או DNA

  1. השג רנ"א הנגיפי ו / או דנ"א מדם כל 1000 μl, סרום או פלזמה, שימוש בבידוד Magna הטהור הקומפקטי חומצות הגרעין שערכה אני ומערכת הקומפקטית הטהורה Magna.
  2. Elute רנ"א או דנ"א זכה בחיץ TE 50 μl. לחלופין, תהליכי טיהור אחרות גרעין חומצות עשויים לשמש.

3. הגברה של אזור env

Amplify אזור env (איורים 2 ו 4) משתי הפלזמה RNA או DNA proviral. 1245 מוצר BP-ארוך, הכולל את רוב חלבון Env (NT 6556-7811 accordinגרמתי לHXB2) שנוצר.

  1. דגימות RNA: תגובת RT-PCR
    1. רנ"א הנגיפי מציג מבנה משני מורכב מאוד (איור 4) שעשוי לעכב את תגובת RT. כדי להימנע מבעיה זו, דגירת 10 RNA μl על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (כבר בצינור PCR ובמכונת PCR) ולאחר מכן מוריד את הטמפרטורה ל 50 מעלות צלזיוס
    2. הוסף 40 μl של מיקס מאסטר כולל PCR primers Env-F וEnv-R.

      מיקס מאסטר לRT-PCR בבית, מערכת:
      נפח / תגובה (μl) ריכוז סופי
      RNase ללא H 2 O 14.4
      מאגר 5x (Qiagen OneStep RT-PCR קיט) 10 1x
      5x Q-פתרון 10 1x
      dNTP מיקס (10 מ"מ כל אחת) 2 400 מיקרומטר של כל dNTP
      Enzym-Mix (Qiagen OneStep RT-PCR קיט) 2
      פריימר Env-F (100 מיקרומטר) 0.3 0.6 מיקרומטר
      פריימר Env-R (100 מיקרומטר) 0.3 0.6 מיקרומטר
      RNase אינהיביטור (RNasin) 1 5 יחידות / תגובה


      Env-F: -3 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA "(6556 nt → 6586 פי HXB2)

      Env-R: -3 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC '(NT 7785 ← 7811)
    3. הפעל את תגובת RT ב 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    4. הפעל את ה-PCR 1 כדלקמן:

      95 מעלות צלזיוס, 15 דקות X 1
      95 מעלות צלזיוס, 30 שניות
      50 מעלות צלזיוס, 30 שניות
      72 מעלות צלזיוס, 2 דקות X 1
      95 מעלות צלזיוס, 30 שניות
      56 ° C, 30 שניות
      72 מעלות צלזיוס, 2 דקות       		38 x
      72 ° C, 10 דקות
      4 מעלות צלזיוס ∞
  2. דגימות DNA: תגובת PCR

    לדגימות DNA proviral, שום תגובת RT ראשונית דרושה, ותגובת PCR ישירות יכולה להתחיל.
    1. הוסף 40 μl של מיקס מאסטר PCR עד 10 μl של DNA provial.


      מאסטר מיקס לPCR בבית, מערכת:
      נפח / תגובה (μl) ריכוז סופי
      RNase ללא H 2 O 15.4
      מאגר 5x (DNA פולימראז HotStarTaq) 10 1x
      5x Q-פתרון 10 1x
      dNTP מיקס (10 מ"מ כל אחת) 2 400 מיקרומטר של כל dNTP
      Enzym-Mix (DNA פולימראז HotStarTaq) 2
      פריימר Env-F (100 מיקרומטר) 0.3 0.6 מיקרומטר
      פריימר Env-R (100 מיקרומטר) 0.3 0.6 מיקרומטר


      Env-F: -3 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA "(6556 nt → 6586)

      Env-R: -3 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC '(NT 7785 ← 7811)
    2. הפעל את תנאי PCR כפי שתואר לעיל עבור דגימות RNA (שלב 3.1.4).

4. הגברה של אזור V3: PCR המקונן

  1. לPCR המקונן, השתמש 5 μl מתגובת PCR הראשונה (ללא ניתוח קודם בagarose ג'ל) כתבנית ולהוסיף 95 μl של מאס PCRמערבב ter.

    מיקס מאסטר ל- בית המקונן בPCR
    נפח / תגובה (μl) ריכוז סופי
    H 2 O 61.9
    מאגר PCR 10x 10 1x
    5x Q-פתרון 20 1x
    dNTP מיקס (10 מ"מ כל אחת) 2 200 מיקרומטר של כל dNTP
    פריימר Env-2F (100 מיקרומטר) 0.3 0.6 מיקרומטר
    פריימר Env-2R (100 מיקרומטר) 0.3 0.6 מיקרומטר
    פולימראז ה-DNA HotStarTaq 0.5 2,5 יחידות / תגובה


    Env-2F: -3 5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC "(6838 nt → 6864)

  2. הפעל את ה-PCR כדלקמן:

    93 ° C, 15 דקות     		X 1
    95 מעלות צלזיוס, 30 שניות
    50 מעלות צלזיוס, 30 שניות
    72 מעלות צלזיוס, 90 שניות     		X 1
    95 מעלות צלזיוס, 30 שניות
    56 ° C, 30 שניות
    72 מעלות צלזיוס, 90 שניות     		43 x
    72 ° C, 10 דקות
    4 מעלות צלזיוס ∞
  3. לנתח את מוצר PCR ב% agarose ג'ל 1 (איור 4). המוצר הצפוי הוא 902 נ"ב ארוכים.
  4. טיהור של דגימות רצף.
    1. לטהר את מוצר PCR עם ערכת Qiagen PCR-הטיהור, באמצעות פרוטוקול, פתרונות ועמודות מייקרו סופק על ידי הספק. Elute במאגר PE 30-100 μl, תלוי בעוצמת להקה.
    2. לחלופין, הדגימות יכולות להיות מטוהרות באמצעות exonucleaseאני והמהיר AP (Thermo אלקליין phosphatase). לצורך כך, להוסיף 6 מיקס μl Exo-AP למוצר ה-PCR 15 μl ודגירה 15 דקות בשעת 37 ° C.
      580 μl H 2 O
      66 μl AP המהיר
      13.4 Exo μl אני

5. תגובת רצף של amplicon V3

  1. תגובת הרצף מורכב מתגובת PCR רק באמצעות אחד מפריימרים הבאים:

    Env-2: -3 5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC (NT 6959 → 6980)
    Env-5: 5'-AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3 '(NT 7352 ← 7371)
    Env-6: 5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3 '(6979 nt → 7000)
    Env-7: 5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3 '(NT 7530 ← 7549)
    Env-10: 5 '- GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3' (NT 7478 ← 7507)
    Env-11: 5 '- TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3' (NT 7638 ← 7664)
    פריימרים בחירה ראשונים הם: Env-2, Env-6 או Env-7, Env-11
  2. השתמש μl 1 מ amplicon V3 המטוהר כתבנית ולהוסיף 9 μl של אדון תערובת PCR.

    סידור מיקס מאסטר:
    4 תמהיל הרצף μl (HIV-genotyping קיט)
    4 μl H 2 O
    1 פריימר μl (100 pmol / μl)
  3. הפעל את תגובת הרצף כדלקמן:
    96 מעלות צלזיוס, 10 שניות
    50 מעלות צלזיוס, 10 שניות 36 x
    60 ° C, 45 שניות
    4 מעלות צלזיוס ∞

6. טיהור של דגימות הרצף

לטהר רצפים USIng Sephadex G-50 עדינים במיוחד.

  1. מלא את המספר המתאים של בארות ב" מטעין העמודה "עם G-50 superfine Sephadex. העברת Sephadex לMAHVN4510 צלחת הסינון לפי מתהפך.
  2. הוסף 300 מילים-Q H 2 O μl לכל באר בצלחת המסנן, ומדגיר אותו ל3h לפחות 2-8 מעלות צלזיוס
  3. צנטריפוגה הצלחות עבור 5 דקות ב910Xg ו4-15 ° C. השלך את הזרימה דרך.
  4. הוסף 10 μl H 2 O למוצר ולאחר מכן רצף pipet הרצף על צלחת Sephadex התנפחה.
  5. כדי לקבל את המוצר המטוהר, סרכזת הצלחת למשך 5 דקות. ב910Xg ו4-15 מעלות צלזיוס ולאסוף זרימה דרך.

7. סידור את הדגימות המטוהרות ברצף ABI פריזמה 3130 XL

  1. לפני כל ריצה, לשנות את החיץ ובדוק את עוצמת הקול של הפולימר (POP7). במידת צורך, להחליף את בקבוק הפולימר הישן באחד חדש.
  2. השתמש בתנאים לרוץ נשמרו, כולל זמן הזרקה של 18 שניות.
  3. במכונה הזאת, האוסף של נתוני האותות של ריצה אחת עם 16 דגימות רצף לוקח בערך 60 דקות (36 סנטימטרי נימים) או 150 דקות (50 סנטימטרי נימים).

8. עריכת רצף

  1. השתמש בתכנית Lasergene (DNA-Star) כדי ליישר ולערוך את הרצפים (איור 5). תוכניות עריכת רצף אחרות עשויות להיות בשימוש. השתמש "B-V3 הסכמה" ורצף קונסנסוס env כהפניות.
  2. Lasergene יוצר רצף קונסנסוס של המדגם נתח משתמש בכל נתוני הגלם זמין ולאחסן אותו כקובץ FASTA. קובץ FASTA הוא קובץ טקסט הכולל את כותרת עם השם של המדגם ורצף נוקליאוטידים.

9. סידור נתונים לפרשנות וחיזוי כמיהות

  1. סידור פרשנות נתונים מתבצע על ידי מערכת הפרשנות מבוססת האינטרנט geno2pheno [coreceptor] (http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php). לניבוי הכמיהות, הגדרות FPR שונות ניתן לבחור. הגדרת ברירת המחדל היא על פי הנחיות הטיפול הגרמני האוסטריות. לFPR ≥ 20%, הנגיף מסווג כR5 כאשר FPR ≥ 20% וX4 לFPR <12.5%.
  2. העלה את הקובץ לשרת FASTA. שרת זה מתרגם את רצף נוקליאוטידים לחומצות אמינו, מיישר אותו ברצף ב-V3 הקונצנזוס ומייצר תת סיווג. בנוסף, הוא מייצר ניבוי של שימוש coreceptor (איור 4) מבוטא בשיעור חיובי כוזב (FPR).

10. נציג תוצאות

Geno2pheno [coreceptor] הפלט מציג פרשנות מדורגת של הכמיהות. בהתאם לסבירות של שימוש coreceptor, טקסט הפרשנות וצבע רקע משתנים מירוק ([coreceptor] תפוקה מתוארות באיור. 6.

figure-protocol-1
איור. 1. שכפול סכמטי של נגיף איידס. virion חייבת לאגד את CD4 הסלולרי כקולט ומשני CCR5 או CXCR4 כcoreceptor. Coreceptor CCR5 יכול להיחסם עם יריבי CCR5 כמו Maraviroc (MVC, Celsentri, Selzentry). לאחר האיחוי של קרומים הנגיפיים ותאיים, nucleocapsid הנגיפי הוא שוחרר בציטופלסמה. Nucleocapsid מפרק והמורכב רנ"א הנגיפי הוא משוחרר לציטופלסמה. Transcriptase ההפוכה הנגיפית (RT) מעתיקה את הרנ"א הגנומי אל תוך הדנ"א proviral, אז שהוא מועבר לגרעין ומשתלב בגנום המארח על ידי אינטגראז-HIV. הנייד רנ"א polymerases transcribe גנומי הנגיפי וRNAs שליח מהגנום proviral. החלבונים הנגיפיים מיוצרים בציטופלסמה והובלו לתא השטח. ניצן חלקיקי הנגיף כvirions לא בוגר, שאינו מזהם מהתאים. פרוטאז ה-HIV חותך את החלבונים לייצור חלקיקים מזהמים. עיכוב של אחד השלבים מובילים להפסקת מחזור השכפול.

את התרופות התרופתיות והצעד שהם מעכבים את השכפול מסומנות באדום.

רנ"א הנגיפי DNA proviral (חומר המשמש לניתוח זיקה או התנגדות) מסומנים בירוק.

figure-protocol-2
איור 2. הגנום proviral איידס. חלקיקי HIV בנוי עם חלבונים מבניים שונים ובתי אנזימים שונים וחלבונים מהמקור נגיפי והן סלולרי. תכנית הדמותזה את המיקום של הגנים בתוך הגנום הנגיפי. משטח חלבוני gp120 ו gp41 מהווים קוצים על פני השטח של virion ולפנות לתא האנושי כדי לבצע את תהליך האיחוי. בחלק התחתון של הדמות, את מוצרי הגברת PCR וprimers המשמש בפרוטוקול שלנו מוצגים.

figure-protocol-3
איור 3. שיעור חולים עם עומס נגיפי נמוך (VL) מדידות נתחו לסמי התנגדות או קביעת זיקה במכון לווירולוגיה, אוניברסיטת קלן (גרמניה).

figure-protocol-4
איור 4. מערך כולל של הניסוי .. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-protocol-5
איור 5. רצף עריכה עם Lasergene. Amplicon V3 הוא רצף עם לפחות אחת קדימה ופריימר הפוך אחד. Lasergene alignes את קבצי ". ABI" מתקבלים מהרצף עם התייחסות הרצפים "V3-Consensus B" וenv. Lasergene יוצר רצף קונסנסוס משתמש בכל נתוני השורה הזמינות. רצפי ההתייחסות יכולים להיות מסומנים (ולאחר מכן מוצג באפור), כך שהם לא תורמים לרצף קונסנסוס המדגם.

figure-protocol-6
איור 6. דיווחי חיזוי כמיהות שנוצרו על ידי geno2pheno [coreceptor] דיווחי tool.The נוצרים כקבצי PDF שניתן לשמור וסיימו במחשב. נתונים נוספים שמו של המטופל כגון, מועד שאיבת דם, וכו ', ניתן לכלול באופן ידני באמצעות תכנית סופר pdf. הערות ספציפיות יכולות להיות גם הוסיפה. Thesנתונים אלקטרוניים הם אך ורק על המחשב של המשתמש ולא על geno2pheno [coreceptor] השרת. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רצף V3 מאפשר חיזוי כמיהות ויראלי אמין, כפי שמוצג במחקרים קליניים 3-9. למעשה, נחישות genotypic ששוקלת בהנחיות הנוכחיות באירופה ובגרמניה אוסטריות 10.

בהשוואה לבדיקה הפנוטיפית, לא רק הוא הזמן הקצר המחזור (שווה ערך לבדיקת התנגדות), אבל גם הם העלויות. בנוסף, יתרון גדול של בדיקת genotypic הוא כי התוצאות מדורגות כFPR ולכן ניתן להתאימו לצרכימים של המטופלים. תוצאות Trofile, לעומת זאת, הן פשוט דוחות R5 או X4, וגישה לנתונים הגולמיים אינה נתונה.

נכון לעכשיו, את ההנחיות האירופיות ממליצות FPR החתוך של 20% 10, בעוד שההנחיות אוסטריות הגרמניות תאפשרנה התאמת FPR חתוך במיוחד לצרכימים של כל מטופל 11. בקו הזה, לחולים עם מגוון רחב של אפשרויות תרופות תרופתיות, FPR הגבוה לחתוך-offs (> 20%) הם recommהסתיים. לעומת זאת, לכבדות חולים שטופלו מראש עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות, FPR הנמוך לחתוך-offs (> 5%) עשויים לשמש. סוג זה של הדרכת טיפול נמשך כיום על ידי ההתנגדות לבדיקת NRTI, NNRTIs, חוקרים פרטיים, וINIS, שם ניתן לכלול תרופות באופן חלקי פעילות-בטיפול בחולים עם אפשרויות טיפוליות מופחתות. בנוסף, עם מספר גדל והולך של שינויי הטיפול genotypically מודרכים-, קליני רלוונטי FPR לחתוך-offs כל זמן להיות מותאם על ידי פנל של bioinformaticians, ירולוגים ורופאים.

יתרון חשוב נוסף של בדיקת זיקת genotypic הוא האפשרות של ניתוח דגימות קליניות עם עומס נגיפי נמוך מאוד או אפילו גילוי (VL). במקרים אלה, כאשר הפלזמה RNA הוא לא amplifiable, DNA proviral יכול להיות רצף ומשמש לתחזיות אמינות 9,12. מן ראוי לציין כי מספר החולים עם עומס נגיפי נמוך או בלתי ניתן לגילוי גדל בצורה חדה בשנים האחרונות. נכון להיום, ה-Trofile assay מאפשר ניתוח של דגימות רק מחולים עם VL <1000 עותקים / מ"ל. עם זאת, מחקרים ראשוניים הראו כי ה-DNA proviral ניתן גם adecuate להיבדק על ידי Trofile 13.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר הווידאו הזה הוא בחסות Viiv בריאות וGlaxoSmithKline.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכותבים ממומנים מקורוס, ערך התא MedSys, השרשרת ופרויקטי Resina.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
שם המגיב חברה מספר קטלוגים תגובות
ערכת Magna טהור קומפקטית חומצות גרעין בידודי אבחון רוש 04 802 993 001
מערכת קומפקטית טהורה Magna אבחון רוש 03731146001
T3000 thermocycler Biometra 050-723
צעד אחד RT-PCR Kit Qiagen 210215
HotStarTaq מאסטר מיקס הערכה Qiagen 203445
ערכת טיהור PCR QIAquick Qiagen 28106
Exonuclease (Exo) Fermentas EN0582
FastAP phosphatase אלקליין Thermosensitive Fermentas EF0651
BigDye שליחות קטלנית v3.1 מחזור רצף הקיט אפלייד Biosystems 4337457
Sephadex G-50 Superfine GE Healthcare 17-0041-01
ABI פריזמה רצף 3130 XL נימים אפלייד Biosystems 3130XL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heger, E., Schuelter, E., Klimkait, T., Lengauer, T., Kaiser, R., Walter, H., Sierra, S. European coreceptor proficiency panel test. 9th European Workshop on HIV & Hepatitis Treatment Strategies & Antiviral Drug Resistance, Paphos, Cyprus, , (2011).
  2. Lengauer, T., Sander, O., Sierra, S., Thielen, T., Kaiser, R. Bioinformatic prediction of HIV coreceptor usage. Nature Biotech. 25 (12), 1407-1410 (2007).
  3. McGovern, R., Dong, W., Zhong, X., Knapp, D., Thielen, A., Chapman, D., Lewis, M., James, I., Valdez, H., Harrigan, P. R. Population-based Sequencing of the V3-loop Is Comparable to the Enhanced Sensitivity Trofile Assay in Predicting Virologic Response to Maraviroc of Treatment-na ve Patients in the MERIT Trial. 17th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, San Francisco, USA, , (2010).
  4. Reuter, S., Braken, P., Jensen, B., Sierra-Aragon, S., Oette, M., Balduin, M., Kaiser, R., Haussinger, D. Maraviroc in treatment-experienced patients with HIV-1 infection - experience from routine clinical practice. Eur. J. Med. Res. 15 (6), 231-237 (2010).
  5. Recordon-Pinson, P., Soulie, C., Flandre, P., Descamps, D., Lazrek, M., Charpentier, C., Montes, B., Trabaud, M. A., Cottalorda, J., Schneider, V., Morand-Joubert, L., Tamalet, C., Desbois, D., Mace, M., Ferre, V., Vabret, A., Ruffault, A., Pallier, C., Raymond, S., Izopet, J., Reynes, J., Marcelin, A. G., Masquelier, B. Evaluation of the genotypic prediction of HIV-1 coreceptor use versus a phenotypic assay and correlation with the virological response to maraviroc: the ANRS GenoTropism study. Antimicrob. Agents. Chemother. 54 (8), 3335-3340 (2010).
  6. Swenson, L. C., Knapp, D., Harrigan, P. R. Calibration and accuracy of the geno2pheno co-receptor algorithm for predicting HIV tropism for single and triplicate measurements of V3 genotype. 10th International Congress on Drug Therapy in HIV Infection, Glasgow, UK, , (2010).
  7. Macartney, M. J., Cameron, J., Strang, A., García, A., Booth, C., Marshall, N., Johnson, M., Geretti, A. M. Use of a genotypic assay for the prediction of HIV-1 coreceptor tropism and guiding the use of CCR5 antagonists in clinical practice. 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).
  8. Sierra, S., Thielen, A., Reuter, S., Jensen, B., Esser, S., Fätkenheuer, G., Lengauer, T., Pfister, H., Sichtig, N., Kaiser, R. Tropism determination and clinical outcome of 61 patients under MVC treatment. 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).
  9. Obermeier, M., Carganico, A., Bieniek, B., Schleehauf, D., Dupke, S., Fischer, K., Freiwald, M., Neifer, S., Schuler, C., Mayr, C., Klausen, G., Köppe, S., üünsche, T., Berg, T., Baumgarten, A. Tropism testing from proviral DNA - analysis of a subgroup from the Berlin Maraviroc cohort. 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).
  10. Vandekerckhove, L. P., Wensing, A. M., Kaiser, R., Brun-Vezinet, F., Clotet, B., De Luca, A., Dressler, S., Garcia, F., Geretti, A. M., Klimkait, T., Korn, K., Masquelier, B. European guidelines on the clinical management of HIV-1 tropism testing. Lancet Infect Dis. 11 (5), 394-407 (2011).
  11. Walter, H., Eberle, J., Möller, H., Noah, C., Wolf, E., St rmer, M., Braun, P., Krn, K., D umer, M., Berg, T., Obermeier, M., Thielen, A., Kaiser, R. Empfehlung zur Bestimmung des HIV-1-Korezeptor-Gebrauchs (DAIG Recommendations for the HIV-1 tropism testing). , (2011).
  12. Obermeier, M. J., Carganico, A., Dupke, S., Schranz, D., Cordes, C., Freiwald, M., Klausen, G., Köppe, S., Schuler, C., Mayr, C., Schleehauf, D., Berg, T., Krznaric, I., Baumgarten, A. Clinical application of genotypic co-receptor tropism testing from viral RNA and proviral DNA: week 24 analysis of the Berlin maraviroc cohort. Journal of the International AIDS Society. 13, Suppl . 4. 129-129 (2010).
  13. Toma, J., Frantzell, A., Hoh, R., Martin, J., Deeks, S., Petropoulos, C., Huang, W. Determining HIV-1 Co-receptor Tropism Using PBMC Proviral DNA Derived from Aviremic Blood Samples. 18th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, San Francisco, USA, , (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

HIV Tropism PredictionCoreceptor Usage AnalysisV3 Region SequencingGeno to Pheno ToolMaraviroc Susceptibility TestingNested PCR AmplificationHIV RNA IsolationSequence Data InterpretationFPR Cutoff AnalysisAntiretroviral Resistance Testing

Related Articles