הטרוגניות מיפוי של ביטוי חלבון בתוך גידולים באמצעות immunofluorescence כמותי

Summary

כאן אנו מתארים שיטה לכמת הטרוגניות מולקולרית בסעיפים היסטולוגית של חומר הגידול באמצעות immunofluorescence כמותיים, ניתוח תמונה, מדד סטטיסטי של הטרוגניות. השיטה מיועדת לשימוש בפיתוח סמן ביולוגי ניתוח קליני.

Abstract

ההטרוגניות מורפולוגיים בתוך הגידול הפרט היא מוכרת היטב על ידי histopathologists בפועל כירורגית. אמנם זה לוקח בדרך כלל צורה של אזורים של בידול מובהק לתוך תת היסטולוגית מוכר, או כיתה פתולוגיים שונים, לעתים קרובות ישנם הבדלים דקים יותר פנוטיפ אשר להתריס סיווג מדויק (איור 1). בסופו של דבר, מאז מורפולוגיה מוכתב על ידי פנוטיפ המולקולרית הבסיסית, אזורים עם הבדלים נראים צפויים להיות מלווה ההבדלים בביטוי של חלבונים אשר לתזמר פונקציה התנהגות הסלולר, ולכן המראה. המשמעות של ההטרוגניות (מולקולרית) נראים ובלתי נראים על הפרוגנוזה אינו ידוע, אך הראיות האחרונות עולה כי, לפחות ברמה הגנטית, קיימת הטרוגניות ^1,2 הגידול הראשוני, וכמה אלה משנה שיבוטים להצמיח גרורתי ( וקטלני לכן) המחלה.

יתר על כן, חלבונים מסוימיםכפי שנמדד על סמנים כי הם מטרות הטיפול (למשל עבור ER ו HER2 עבור טמוקסיפן ו trastuzumab (הרצפטין), בהתאמה). אם חלבונים אלו מראים ביטוי משתנה בתוך הגידול אז התגובות טיפולית יכול להיות גם משתנה. תוכניות בשימוש נרחב הבקיע היסטופתולוגיות עבור אימונוהיסטוכימיה או להתעלם, או מספרית homogenize כימות של ביטוי חלבונים. באופן דומה, טכניקות הרסניות, שבו דגימות הגידול הם הומוגני (כגון פרופיל ביטוי גנים), מידע כמותי ניתן הובהר, אך מידע מרחבי אבוד. מיפוי גנטי ההטרוגניות גישות בסרטן הלבלב יש לסמוך גם על דור של השעיה תא בודד ^3, או ⁴ macrodissection. מחקר שנערך לאחרונה השתמשה נקודות קוונטיות כדי למפות ההטרוגניות מורפולוגיים מולקולרית ברקמת סרטן הערמונית ^5, לספק הוכחה של עקרון זה מיפוי מורפולוגיה מולקולרית אינו ריאלי, אבל נפילה שלhort של לכימות ההטרוגניות. מאז אימונוהיסטוכימיה הוא, במקרה הטוב, רק חצי כמותית ובכפוף ההטיה התוך והבין הצופה, יותר רגישים ו - מתודולוגיות כמותיות נדרשים על מנת למפות במדויק ולכמת ההטרוגניות רקמות באתרם.

פיתחנו מתודולוגיה ויושמו ניסויים סטטיסטיים על מנת לכמת את ההטרוגניות באופן שיטתי ביטוי חלבון בסעיפים רקמה שלמה של גידולים, בהתבסס על ניתוח כמותי אוטומטי (AQUA) מערכת ^6. סעיפים רקמות מסומנים עם נוגדנים ספציפיים כנגד cytokeratins ויעדים של עניין, מצמידים את fluorophore שכותרתו נוגדנים משני. שקופיות הם צילמו באמצעות סורק כל שקופית פלואורסצנטי. תמונות מחולקים מאות עד אלפי אריחים, וכל אריח מוקצה אז ציון AQUA שהיא מדד של ריכוז חלבון בתוך הרכיב (גידולים) של רקמת האפיתל. Heatmaps נוצרות לייצג ביטוי רקמות של חלבונים ציון ההטרוגניות מוקצה, באמצעות מדד סטטיסטי של ההטרוגניות ששימשו במקור אקולוגיה, בהתבסס על מדד סימפסון המגוון הביולוגי ^7.

עד כה לא היו ניסיונות שיטתי למפות ולכמת את השתנות בד בבד עם ביטוי חלבון, בהכנות היסטולוגית. כאן, אנו ממחישים את השימוש הראשון בשיטה להחיל ER ו HER2 ביטוי סמן ביולוגי בסרטן השחלות. באמצעות שיטה זו סוללת את הדרך לניתוח ההטרוגניות כמשתנה בלתי תלוי מחקרים הביטוי סמן במחקרים translational, כדי להקים את המשמעות של ההטרוגניות על הפרוגנוזה וחיזוי התגובות לטיפול.

Protocol

1. רקמות הכנה

1. Microtomy
   1. פרפין פורמלין מדור קבוע משובצים אבני הגידול בכל עובי 4 מיקרומטר באמצעות microtome סיבובית.
   2. מניחים את החלקים על גבי שקופיות מיקרוסקופיים בעלי מטען חשמלי חיובי.
   3. דגירה שקופיות 37 מעלות צלזיוס בתנור למשך הלילה.
2. אחסון
   1. סעיפים אחסן -18 ° C עד -25 ° C במקפיא, כדי למנוע אובדן antigenicity.

2. Immunofluorescence סעיפים רקמה

1. Dewaxing ו Rehydration
   1. Dewax שקופיות קסילן פעמיים 5 דקות.
   2. רעננותם שקופיות 99%, 99%, 80%, 50% אתנול לברז מים זורמים במשך 2 דקות כל אחד לפי הסדר.
2. Antigen Retrieval
   1. ביצוע אחזור המושרה חום אנטיגן, באמצעות נתרן 0.15 mM ציטראט, pH 6.0 חיץ בסיר לחץ 5 דקות של microwave.
   2. תירגע שקופיות עבור 20 דקות.
   3. יש לשטוף שקופיות PBST 0.05% עבור 5 דקות על הנדנדה.
3. חסימת ההליך
   1. התייחס מקטעים מי חמצן 3% עבור 10 דקות.
   2. יש לשטוף שקופיות PBST 0.05% עבור 5 דקות על הנדנדה.
   3. הוסף את הסעיפים כדי מתלה Immunostaining Sequenza.
   4. פנקו את הסעיפים לחסום סרום חלבון חינם 10 דקות.
4. נוגדן ראשוני הדגירה
   1. נוגדן דגירה ראשי מדולל כדי דילול אופטימלי diluent נוגדן Dako שעה 1 בטמפרטורת החדר.
   2. לשטוף ב 0.05% PBST שלוש פעמים עבור כל 5 דקות.
5. מסכה אפיתל (Cytokeratin) הדגירה
   1. דגירה עכבר אנטי מחבת cytokeratin, בדילול 1:50 ב diluent נוגדן Dako לילה בשעה 4 ° C.
6. מסכה אפיתל להדמיה
   1. הכן דילול 1:25 השעיר אנטי עכבר Alexa555 sנוגדן econdary ב טרום בדילול Envision עזים ארנב פתרון HRP נוגדן. דגירה שקופיות בחושך במשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר.
   2. לשטוף ב 0.05% PBST שלוש פעמים עבור כל 5min.
7. יעד להדמיה
   1. העברת שקופיות Sequenza לחדר לחות.
   2. שילוב האות יעד הגברה diluent (HistoRx E באמבטיה) ואת Tyramide Cy5 (F HistoRx צינור) בריכוז 1:50. וורטקס לערבב היטב. דגירה שקופיות בחושך במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. לשטוף ב 0.05% PBST שלוש פעמים עבור כל 5 דקות.
   4. מייבשים שקופיות אתנול 80% דקות 1.
   5. האוויר יבש שקופיות בחושך.
8. Counterstaining ו coverslipping
   1. החל בינוני DAPI גובר על coverslips והמקום coverslips על סעיפים רקמות.
   2. מגלשות יבשות לילה בחושך.
   3. לאחר השקופיות התייבשו, מאובטח עם לק על enשימור בטוח לטווח ארוך לשמור על מקרר 4 מעלות צלזיוס.

3. תמונה ללכוד באמצעות סריקת קטע שלם

1. טען עד חמש שקופיות קלטת את השקופית של סורק שקופיות ScanScope פלורידה Aperio.
2. עבור כל שקופית, בחר את האזור הרחב תמונה באמצעות ממשק במסוף ScanScope. בחר את האזור על מנת להקיף את כל רקמת בשקופית, ללא קשר מכתים דפוס או היבטים אחרים של הנצפה במדגם.
3. שימוש במסוף ScanScope, לכל ערוץ (DAPI, Cy3 ו Cy5) לקבוע חשיפה אופטימלית כדלקמן:
   1. בחר אזור של רקמה לחקור - אזור זה אמור, באופן אידיאלי, להיות באזור של רקמת הגידול כדי לספק את הייצוג הטוב ביותר.
   2. באמצעות התכונה autoexposure ScanScope Console, להעריך את זמן החשיפה הציע עבור כל ערוץ, יחד עם מוקד התמונה.
   3. חזור על עד 3-5 אזורים של כל דגימה לשתףnfirm היציבות של הערך.
4. בחר אזור נוסף (כפי שמוצג על ידי יהלום כחול על התמונה המסוף ScanScope) מן הרקמה, אך עדיין בתוך האזור coverslipped של השקופית, כדי להגדיר אזור שבו הרקע שטוח תיקון ותמונות שדה יירכשו עבור כל מסנן.
5. סקירה התמונות האלה לפני רכישת התמונה. אם התמונות נראה כי הרקע גבוה או חפצים תמונה אחרת, תמונה האזור יש להעביר ותמונות חדש שנרכש.
6. התמונות רכשה שקופיות דיגיטלית נטען באופן אוטומטי לתוך מסד הנתונים ספקטרום Aperio.

4. AQUA ניתוח התמונה אוטומטית

1. הצגת תמונות דיגיטליות שקופיות שלם באתר ספקטרום ולהוסיף הערות אזורים הגידול של עניין בהקשר של הרקמה כולה דפוס מכתים (ים).
2. בחר את השקופית לנתח באמצעות AQUAnalysis מהרשימה שקופיות דיגיטלי באתר ספקטרום ידי לחיצה כפולה על האגודלתמונה מסמר (לחלופין, בחר את תיבת הסימון לצד התמונה ולאחר מכן בחר "הצג תמונות" מתוך התפריט בחלק העליון של הרשימה). זה פותח באופן אוטומטי את התוכנה ImageScope ותמונה צבע הממוזגת של המדגם רקמות.
3. השתמש בתוכנה זו כדי לנווט את התמונה באמצעות הכלים הניתנים.
4. באמצעות H & E המלווה (או את השקופית פיזית או תמונה המבואר), ויסמנו את האזור הריבית על התמונה ניאון. באזורים מרובים של עניין, פרט הקיף תחומים, ניתן לבחור על מדגם יחיד. יש גם כלי 'שלילית' המשמש אי הכללה של אזורים בתוך האזור שנבחר (כלומר רקמות שניזוקו, תחומי היסטולוגיה עניים, שאינם אזורי הגידול, פסולת וכו').
5. שמור את שכבת ביאור (ים) על התמונה.
6. לחזור לתפריט הראשי ספקטרום בחר את תיבת הסימון ליד התמונה היה רק ​​המבואר. בחר "נתח" מרצועת תפריט לרוחב החלק העליון של הרשימה.
7. בחלון ניתוח אשר יעלה, Select "HistoRx ניתוח AQUA" מתוך התפריט הנפתח.
8. אם קיימות מספר שכבות של הסברים, להשתמש בתיבות הסימון כדי לבחור את השכבה המתאימה (ות) עבור ניתוח.
9. לחצו על "נתח" כפתור כאשר מוכן להתחיל.
10. בשלב זה, חלון ממוזער קונסולת יופיע בשורת המשימות של Windows. זה יציג את התקדמות העברת תמונות ממסד הנתונים ספקטרום למחשב המקומי (פעולת "משיכה").
11. ברגע שהנתונים הועברו, AQUAnalysis תשיק. המשתמש יכול אז להשתמש בכל הפונקציות הפנימיות של התוכנה כדי להציג, לנווט לנתח תמונות.
12. האזור המבואר של התמונה ממסד הנתונים ספקטרום מחולק אריחי תמונה 512x512 פיקסל - שכל אחד מהם יהיה הבקיע בנפרד.
13. במחקר זה, אלגוריתם הבקיע ללא השגחה AQUA, בהתבסס על נתונים באשכולות, היה בשימוש ^8. ב אלגוריתם זה, עשרות AQUA נוצרות כדלקמן:
    1. התמונה הפאן cytokeratin סיgnal הוא thresholded מעל הרקע פיקסלים אלה משמשים להגדרת הגידול "מסכה" אשר משמש אז לחישובים הבאים. הביטוי גבוהה הפאן cytokeratin פיקסלים גם להגדיר את האזורים cytoplasmic / אי - גרעיני של תאים סרטניים.
    2. פיקסלים עם אות גבוה בערוץ DAPI כי הם בתוך המסכה הגידול מזוהים גרעיני בטבע.
    3. האלגוריתם באשכולות בוחן גם פיקסלים אשר בעצימות נמוכה עבור מכתים או DAPI או ביטוי cytokeratin ומנסה חלקית לייחס להם גם את גרעיני תאים או cytoplasmic, או רקע.
    4. לאחר כל הפיקסלים מוקצים אחד התאים סרטניים או רקע, את עוצמת האות חלבון המטרה (ER או HER2) המחושב אז בתוך כל אחד תאים ו מנורמל לגודל של תאים, ובכך לייצר עשרות AQUA.
    5. תמונות אשר לא היה ייצוג הגידול מספיק לא דורגו (כפי שהוגדר על ידי בעלי less יותר מאשר 5% פיקסלים המייצגים גידול). אזורים אלה גם לייצר ערך "התוצאה הסופית" שנקרא "Fail" ולכן יכול להיות מוסר ניתוחים סטטיסטיים הבאים.
    6. בנוסף, אם לאחר בדיקתה, מפעילת שדות מזוהה אשר אינם מתאימים ניקוד בשל מדגם או חפצים הדמיה (כגון פסולת מקופל, רקמות), שדות אלה היו redacted מן הניקוד והפיק "תוצאה סופית" שנקרא "Fail".
14. תוצאות הניקוד AQUA הם שולחנות של עשרות קשור כל אריח 512x512 פיקסל באזור של עניין בתוך דגימת רקמה כל סעיף. קבצים אלה, בפורמט CSV., לאחר מכן ניתן להשתמש לניתוח סטטיסטי הבאים.

5. ניתוח סטטיסטי: כל ניתוח סטטיסטי מבוצעות SPSS (IBM)

1. במידת האפשר, עבור פעולות גדולות, ליצור קוד SPSS תחביר קבצים (. SPS) לבצע מניפולציות נתונים צעדים ניתוח. תחביר קוד דוגמה מסופק כקובצי המשלים.
3. איפה יש אזורים "התוצאה הסופית" של "Fail" (ראה לעיל), לסמן את הערכים הללו כמו SYSMIS, אשר מסיר מהם הניתוחים מספרית.
4. המצטבר של כל הנתונים עבור כל השקופיות עבור כל סמן (ER או HER2) לתוך נתונים אמן יחיד מוגדר בפורמט SPSS. השתמש בקובץ זה מתאר את כל החישובים הבאים.
5. באמצעות קובץ תחביר SPSS (אחד עבור כל סמן: ER או HER2 (ראה תחביר קבצים השלמה) נתונים היה תוקף נוסף מדדי סימפסון המגוון מחושב באופן הבא:
   1. יצירת קובץ אב אנליטי, על מנת למנוע שינוי של נתוני האב מוגדר שנוצר בעבר.
   2. אמת את הנתונים אמן על רקע נתונים ותמונות הגלם שנוצר.
   3. תוצרת סטטיסטיקה סיכום עשרות AQUA עבור כל דגימה (ספירה של שדות, כלומר, ציון הציון החציוני, minimuציון מ ', ציון מקסימלי, וסטיית התקן של עשרות למדגם).
   4. בדקו מדגם אקראי של התוצאות מול הנתונים הגולמיים הקבצים המקוריים פלט ונגד נתוני התמונה גלם הבקיע.
6. כדי להפיק את התמונות למפות חום (מוצג איורים 2 ו -3):
   1. "סל" את הציון נתונים AQUA (באמצעות פונקציית "binning חזותית" ב SPSS) לשמונה רמות בודדים. עבור ER, עשרות גרעיני שימשו, עבור HER2, עשרות cytoplasmic היו בשימוש.
   2. לגזור פחי כזאת כל בן מייצג אחוז שווה של מקרים זמינים להגדיר את הנתונים כולו.
   3. השתמש ב 'פצל קובץ "הפונקציה SPSS כך שכל פלט הבאים יהיו ברמה" מדגם לכל שקופית / ".
   4. מגרש כל האזור (המקביל ל אריח 512x512) על ידי x שלה, קואורדינטות y וצבע עם ערך המתאים סל שלתוכו הוקצו (ראה דמויות 2 ו -3).
7. כדי ליצור עשרות הטרוגניות, קוד שנכתב כדי ליצור סימפסוןמדד הגיוון באמצעות עשרות AQUA.
   1. מדד סימפסון של גיוון, משמש כאן, מוגדר כ:
      
      כאשר n הוא המספר הכולל של עשרות / שדות המשמשים מדגם נתון n הוא מספר עשרות / שדות בקבוצה מסוימת של עשרות סטנדרטית (המיוצר כמתואר להלן).
8. השתמש בקובץ אב אנליטית שתוארו לעיל עבור מקור הנתונים. בדוגמאות המוצג, כל החישובים ER משמש את הציון AQUA גרעיני HER2 חישובים המשמשים את הציון AQUA cytoplasmic. בצע את החישובים להלן מדגם זה / שקופית.
9. מאז נתוני הקרינה כפוף יציבות שונות, כך גודל השגיאה מתפשטת בעוצמה, להחיל נורמליזציה לוגריתמי (בבסיס 2) לכל עשרות AQUA.
10. יתר על כן להפוך את מנורמל (יומן טרנספורמציה) נתונים לתוך-Z (רגיל) ציונים.
    1. השינוי Z-הציון מחושבזה כדלקמן: Z = (ציון AQUA - הממוצע של כל הציונים למדגם) / סטיית תקן של ציוני למדגם. זה מתרגם את התפלגות הציונים לתוך ההפצה של סטיות סביב הערך המרכזי של סטייה אפס.
11. סל אלה Z-ציון ערכים לשש קבוצות (<-2, -2 - -1, -1 - 0, 0 - 1, 1 - 2,> 2).
12. חשב את מספר הערכים שהוקצו לפח כל סכום עבור כל סל. השתמש בערך זה, יחד עם המספר הכולל של שדות, כדי לחשב ערך עבור כל אחד מששת סלי משמש המדד.
13. סכום הערכים הללו ולהחסיר מאחד לייצר מדד של גיוון.
14. מדד הגיוון מספק אינדיקציה להתפשטות עשרות סביב הממוצע עבור מדגם מסוים. לפיכך, המדדים גבוהים מצביעים על התפשטות רחבה יותר של ציונים, או הטרוגניות מוגברת של הביטוי. לעומת זאת, מדדים נמוכים יותר, מצביעים על וריאציה פחות מדידה ביטוי והבעה הומוגנית במדגם. זו באה לידי ביטוי ב Figures 2 ו -3.

6. נציג תוצאות:

טיפול ממוקד עם סוכנים רעילות נמוכה יחסית, כגון טמוקסיפן ו trastuzumab, לא טיפול סטנדרטי עבור חולים בסרטן השחלות. ישנן ראיות טובות פלטינה taxane כימותרפי קו ראשון עדיפה על כימותרפיה אחרים לסרטן השחלות ^9-13, ובעוד 70-80% מהחולים מגיבים בהתחלה, רוב תהיה הישנות ולמות של המחלה. מדידה של סמנים ביולוגיים אשר עשוי לנבא בתגובה טיפולים אלטרנטיביים יהיה שימושי בבחירת טיפול אינדיבידואלי לכל מטופל, ומאז מפעילה לחץ מבחר כימותרפיה על הגידול, התאים הסרטניים לשרוד עשויים להחזיק מאפיינים שונים מייצגים subpopulation של הגידול לפני הטיפול; לכימות זה השינוי עשוי אפוא להיות שימושי. אנו מוחלים מיפוי ההטרוגניות שלנו גישה ביטוי ER ו HER2 בסרטן השחלות דגימות לפני ואחרי כימותרפיה, ב אורדr כדי למדוד את השינויים הכמותיים הביטוי, להעריך את הקשר בין הביטוי סמן לפני ואחרי הטיפול. שני ER ו HER2 להפגין ההטרוגניות מסומן בתוך גידולים הפרט, בגידולים מסוימים, השינויים במדד סימפסון לאחר טיפול של הטרוגניות גבוהה יחסית ההטרוגניות נמוך, מיוצג על ידי הפחתת ניקוד מדד סימפסון (ראה איורים 2 ו -3). זה תומך ברעיון כי הבחירה המשובטים מתרחשת בתגובה כימותרפיה ציטוטוקסית, וחשוב יותר, זו עשויה להיות מנוצלת באמצעות טיפול ממוקד נגד האוכלוסייה השיורית, כדי להיטיב אישית בטיפול בחולי סרטן.

1. איור Hematoxylin ו eosin photomicrographs צבעונית של אזורים שונים של סרטן השחלות באותו מראה מורפולוגיה משתנה. (א) X40 photomicrograph מציגה שני אזורים סמוכים של הגידול משתנה עם המורפולוגיה. כוח צפיות גבוהה (X200) חושפים תאים עם ניקוי cytoplasmic דפוס יציב של צמיחה בחלק העליון של הגידול (ב), ואילו את החלק התחתון של הרקמה (ג) יש יותר הומוגניות הציטופלסמה eosinophilic ואת דפוס הגדילה פפילרי. גידול זה היה, עם זאת, להיות מסווגים תת נסיובי היסטולוגית papillary למטרות של ניהול נוספים.

באיור 2. Heatmaps הטרוגניות של ביטוי חלבון ER ברקמות cytokeratin חיובי סרטן השחלות, לפני (פאנל עליון) ואחרי טיפול (הפאנל התחתון).

באיור 3. Heatmaps הטרוגניות של ביטוי החלבון HER2 ברקמות cytokeratin חיובי סרטן השחלות, לפני (הפאנל העליון) וטיפול לאחר (הפאנל התחתון).

Discussion

השיטה המתוארת להלן היתרי כימות הטרוגניות מולקולרית ברמת פורמלין-קבוע, פרפין, משובצים קטעים היסטולוגית של חומר הגידול. השיטה מאפשרת הערך יוקצו מידת ההטרוגניות בקטע הרקמה, כך זה עשוי אז להילקח בחשבון כמשתנה בפיתוח סמן ביולוגי וניתוח. אמנם באופן כללי עדיף כי הם סמנים רקמה הומוגנית מבחינת הביטוי, כך assay הוא פחות רגישים טעות הדגימה או משוא פנים, זה עלול בנסיבות מסוימות להיות שימושי לכמת ההטרוגניות כפרמטר. לדוגמה, כפי שמוצג בדוגמה המחשה של ER ו - HER2, סמנים נפוצים להראות הטרוגניות רבה ביטוי זה כרגע לא ידוע אם זה מהווה גורם מנבא עצמאי או חזוי לגבי התוצאה הקלינית או התגובה לטיפול, בהתאמה. כמו כן, כפי שמודגם, הטיפול עצמו עלול לשנות באופן דינמיאוכלוסיות המרכיבים של תאים, ולכן מדידה של העשרה היעד עשוי להיות שימושי המנחה החלטות הטיפול.

עם זאת, הטכניקה היא מוגבלת על ידי אותם גורמים אשר מגבילים מנתח histopathological או סמנים ביולוגיים (כגון immunohistochemical) המסורתית. התוצאה היא תלויה בסוג, גודל, איכות של הרקמה להיות מנותח, ולכן קטע רקמה יחיד לא יכול להיות נציג של הגידול כולו. ואכן, המדד סימפסון עשוי להיות מוטה יתר על המידה על ידי גודל של הרקמה (מספר מסגרות בשבי עשרות AQUA נמדד). Immunogenicity של epitopes הנמדדים עשויים להיות כפופים טרום ניתוח גורמים בלתי נשלט אשר artifactually לשנות את הביטוי שלהם על פני קטע הרקמה (כגון זמן איסכמיה קר, או את האורך של קיבעון, ו חפץ קצה). זוהי בעיה במיוחד עבור-epitopes phospho, אשר ידוע לשמצה יציב ^{14, 15.} לכן הטכניקה עשוי להיות מתאים יותרעל דגימות ביופסיה כריתה ולא קטן, שבוצעו על מספר מקטעים ולא רק אחד. בסופו של דבר, 3D שיטות הדמיה עשויות להציע הזדמנות טובה יותר לכמת בפרמטר זה.

הטכניקה כפי שהוצגה עשוי להיות מוגבל על ידי גורמים ביולוגיים, כגון השתנות בביטוי של epitope מיסוך cytokeratin. זה עלול להיות מדאיג במיוחד בסוגי סרטן אלה, כולל סרטן השחלות וסרטן השד, אשר עוברים אפיתל ל-mesenchymal המעבר (EMT) או מועשרים שאינם אפיתל רכיבים או בתאי גזע ^16, כמו לאחרונה הוכח להתרחש כימותרפיה טיפול בסרטן השחלות ב ¹⁷ במבחנה, ועל חולי סרטן השד בעקבות טיפול ^18. מגבלה זו ניתן להתגבר באמצעות נוגדנים מיסוך חלופה (או קוקטיילים של נוגדנים), כגון cytokeratin פלוס vimentin, אשר שהוגברו ב EMT ^16. בנוסף, מאז רכיבים אחרים של הרקמה (את המיקרופוןroenvironment), כגון fibroblasts או בתאי האנדותל בכלי הדם הם גם יותר ויותר ממוקדים על ידי טיפולים ביולוגיים, הטכניקה עשויה גם להיות מורחבת כדי להבקיע רכיבים אלה, באמצעות מסכות ספציפיות תאים של עניין, כגון PECAM / CD31 להכתים עבור לתאי אנדותל של כלי הדם .

למרות העיבוד של מדד סימפסון שימש כמדד ההטרוגניות בפרוטוקול הנוכחי בשל פשטותה, אמצעים אחרים של ההטרוגניות יכול לשמש, כגון מדידות פשוטה של ​​נטייה מרכזית (ממוצע, חציון השונות, וכו '). בנוסף, חישובי מדד סימפסון יכול להיות שונה כדי להתאים טוב יותר אוכלוסייה מבחן בפרט. השימוש Z-ציון טרנספורמציות מאפשר הניקוד יהיה רלוונטי יותר עבור מספר רב של סמנים מאז ההטרוגניות מבוסס על סטיית סביב הממוצע עבור ערכת נתונים. עם זאת, בטווח הכולל של מניה יכולה להיות מוגבלת בסוג זה של טרנספורמציה. עיצובים מסוימים עשויים להיות מתאימים יותרפשוט בן עשרות AQUA בפועל עבור כל דגימות של קבוצה סמן מסוים. בחירת מספר פחי הפסקות גם הגבלה בטווח של ערכים אשר עלולה לגרום ועלול להיות מותאם עיצובים ניסיוניים חלופיים.

השתמשנו ER ו HER2 במחקר הנוכחי כמו סמנים מועמד, כיוון שהם משמשים כבר במרפאה, לעזור לענות על שאלות קליניות רלוונטי לגבי היעילות של טיפולים ממוקדים, ידועים להפגין ההטרוגניות שינוי ניכר והן הראשוני רחוק המחלה ^19. עם זאת, סמן אופטימלי של ההטרוגניות נותר נחוש. אפשרויות אחרות עשויות לכלול סמנים cytogenetic של clonality, כגון אלו המשמשים בעבר במחקרים FISH שלבי הביניים ^20. הגישה דורשת אימות נוסף, קבוצות גדולות קליניים המבואר טוב או ניסויים קליניים על מנת להמשיך ולבסס את הרלוונטיות של פרמטר זה בביולוגיה של הסרטן.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
ScanScope פלורידה	Aperio	ScanScope פלורידה	משמש מצויד כמו מהספק
ספקטרום	Aperio	ספקטרום	מספרים תצורה קטלוג ישתנו כיצד מוסדות מקומיים להקים מסד הנתונים שלהם ו-IT מבנה.
AQUAnalysis, בשיתוף עם AQUAjustment	HistoRx	V2.3	החבילה מאפשרת AQUAjustment AQUAnalysis להשתמש בתמונות המאוחסנות ספקטרום.
HER2	Dako	A0485	1 בדילול 400
עכבר אנטי מחבת cytokeratin	Dako	M3515	1 בדילול 50
נוגדן diluent	Dako	S0809
Envision עזים ארנב HRP	Dako	K4003
חלבון לחסום	Dako	X0909
עיזים אנטי עכבר Alexa555	Invitrogen	A21422
DAPI בינוני הרכבה	Invitrogen	P36931
Cy5 Tyramide	HistoRx	AQ-EMR1-00001
Sequenza מרכז Immunostaining	Thermo Scientific Shandon	73300001	משמש כאן מכתים הספסל העליון immunofluorescence