Method Article

ויזואליזציה של Caenorhabditis elegans לציפורן מבנים באמצעות דיי ויטל lipophilic, DiI

DOI:

10.3791/3362

⸱

January 30th, 2012

 , 
1Department of Molecular and Cellular Medicine, Texas A&M University System Health Science Center, College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים שיטה לחזות לציפורן ב לחיות ג elegans באמצעות צבע אדום ניאון lipophilic DiI (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3 ", 3'-tetramethylindocarbocyanine פרכלורט), אשר נפוץ ג elegans לדמיין עצב חשוף לסביבה. באמצעות פרוטוקול זה מותאם, alae ו טבעתי מבנים cuticular מוכתמים על ידי DiI והבחין באמצעות מיקרוסקופ המתחם.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לציפורן של C. elegans הוא מבנה עמיד מאוד שמקיפה את החיצוני של 1-4 בעלי חיים. לציפורן לא רק מגן על בעלי החיים מהסביבה, אלא גם קובעת את צורת הגוף ואת תפקיד תנועתיות 4-6. כמה שכבות מופרש על ידי תאים אפידרמיס מהווים את לציפורן, כולל שכבת השומנים החיצונית 7.

רכסים ההיקפי לציפורן הנקרא דפוס annuli אורך החיה נוכחים במהלך כל שלבי ההתפתחות 8. Alae הם רכסי האורך שנמצאים בשלבים מסוימים של פיתוח, כולל L1, dauer, ובשלבים מבוגרים 2,9. מוטציות בגנים המשפיעים על הארגון קולגן cuticular יכול לשנות את מבנה הגוף החי cuticular מורפולוגיה 5,6,10,11. בעוד דימות באמצעות מיקרוסקופ cuticular מתחם עם אופטיקה DIC אפשרי, השיטות הקיימות המדגישות מבנים cuticular כוללים נורותאחוז transgene הביטוי 12, מכתים נוגדן 13, במיקרוסקופ אלקטרונים 1. תווית נבט חיטה agglutinin (WGA) שימש גם לדמיין גליקופרוטאינים cuticular, אבל היא מוגבלת בפתרון מבנים cuticular עדינה 14. הכתמה של פני השטח cuticular באמצעות צבע פלואורסצנטי נצפתה, אך מעולם לא מתאפיין בפירוט 15. אנו מציגים שיטה לחזות לציפורן של חיים ג elegans באמצעות ניאון אדום lipophilic לצבוע DiI (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3 ", 3'-tetramethylindocarbocyanine פרכלורט), אשר נמצא בשימוש נפוץ ב C. elegans לדמיין עצב חשוף לסביבה. זה פרוטוקול אופטימיזציה עבור מכתים DiI היא שיטה פשוטה, חזקים להדמיה ברזולוציה גבוהה הניאון של annuli, alae, הפות, זנב זכר, אנדרוגינוס זנב ספייק ב C. elegans.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת DiI כתם

  1. הכן פתרון מלאי של DiI 20 מ"ג / מ"ל ​​(Biotium, Inc, הייוורד, קליפורניה) ב DMF. DiI אור רגישים, כל כך להגן DiI מן האור על ידי לפפה בנייר כסף.
  2. צור דילול העבודה של DiI ידי הוספת 0.6 μL מניות DiI ל 399.4 M9 μL לכל אוכלוסיית. זה אמור לתת דילול עובד הסופי של 30 מיקרוגרם / מ"ל ​​DiI ב M9. זה יכול להיות scaled עד מכתים עבור אוכלוסיות מרובות בו זמנית. מגן DiI מן האור על ידי עטיפת הצינור (ים) בנייר.

2. הכנת נמטו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה מכתים DiI המוצג כאן מאפשר דרך מהירה ונוחה יחסית לדמיין את הקוטיקולה של C. elegans. לפי repurposing וייעול שיטת נפוץ נוירונים תמונה חשופה לסביבה החושית 15,17, DiI ניתן להשתמש fluorescently כתם הן alae ומבנים טבעתי (איורים 1 ו -2), כמו גם את הפות, זנב זכר, אנדרוגינוס זנב ספייק (איור 3). מצאנו כי הפתרון הדגירה והשפעה זמן את היכולת של DiI באופן עקבי הכתם לציפורן (טבלה 1, איור 4). השיטה נוירונים DiI חשוף לסביבה מכתים משתמשת זמן של שעתיים הדגירה ב M9 עם טריטון .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין לנו שום דבר לגלות.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מבקשים להודות ש-Taneja Bageshwar, ק Beifuss, ש Kedroske, ו HC. סיאו לדיונים מועילים. עבודה זו מומנה על ידי סטארט אפ קרנות מהמחלקה TAMHSC לרפואה מולקולרית תאית. היקף המתחם דיסק ספינינג נרכשו במימון המחלקה לבין משרד TAMHSC של הדיקן. זנים מסוימים סופקו על ידי גנטיקה Caenorhabditis מרכז, אשר ממומנת על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר. pRF4 (רול-6 (su1006)) הייתה מתנה האש א.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ריאגנטים מילים נרדפות חברה מספר קטלוגי תגובות
DiI 1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3 ", 3'-tetramethylindocarbocyanine פרכלורט Biotium, Inc 60010 במלאי דילול:
20 מ"ג / מ"ל ​​DMF
דילול עובדים: 30 מ"ג / מ"ל
DMF Dimethylformamide Sigma-Aldrich, Inc D4551
טריטון
X-100 		Octylphenoxypolyethoxyethanol VWR הבינלאומי, LLC. EM-9410
M9 22mm KH 2 PO 4, 42mM Na 2 HPO 4, 86mM NaCl, 1mm MgSO 4
NGM צמיחה נמטודות בינוני IPM מדעיים, Inc 11006-501 יכול להיות מוכן הבאים פרוטוקול NGM אגר 18
Agar-agar EMD כימיקלים, Inc 1.01614 4% מים
Levamisole Levamisole hydrochloride Sigma-Aldrich, Inc 31742 100 מיקרומטר - 1 levamisole mM כנדרש
מיקרוסקופ שקופיות VWR הבינלאומי, LLC. 16005-106
לכסות מיקרוסקופ משקפיים VWR הבינלאומי, LLC. 16004-302
מתחם היקף Carl Zeiss, Inc A1m השתמש המטרות כדי להתאים את הצרכים של הניסוי
המסנן תואם TRITC או אחרים   Chroma טכנולוגיה קורפ 49005 ET - DSRed (TRITC/Cy3) גמגם להגדיר מסנן

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization. The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).
  2. Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C elegans CuticleDiI StainingFluorescent DyeCuticle VisualizationNematode StainingAnnuli AlaeFluorescence MicroscopyLipophilic DyeCuticle StructureLive Imaging

Related Articles