ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

סיכום

Uncoating היא צעד חיוני בשלב מוקדם של מחזור HIV-1 חיים מוגדר פירוק של הקליפה capsid ואת שחרורו של המתחם ribonucleoprotein ויראלי (vRNP). כאן, אנו מדגימים טכניקות לבידוד גרעינים שלמים מן HIV-1 ו virions לכימות uncoating שלהם במבחנה.

תקציר

הגנום של רטרווירוסים הוא עטוף capsid מוקף במעטפת השומנים. עבור lentiviruses, כגון HIV-1, הקליפה חרוטי capsid מורכב החלבון CA מסודרים כמו סריג של משושה. Capsid סגור על ידי 7 pentamers בסוף רחב 5 בקצה הצר של חרוט ^{1, 2.} עטוף במעטפת זו capsid הוא מורכב ribonucleoprotein ויראלי, ויחד הם מהווים את הליבה.

בעקבות איחוי של קרום ויראלי עם קרום התא היעד, HIV-1 הוא שוחרר לתוך הציטופלסמה. Capsid אז מפרק שחרור CA חינם בצורה מסיסה ³ בתהליך המכונה uncoating. המיקום והעיתוי תאיים של uncoating-HIV-1 הם הבינו היטב. חומצה אמינית בודדת החלפות ב-CA אשר משנים את יציבות capsid גם לפגוע ביכולת של HIV-1 להדביק תאים ^4. זה מצביע על יציבות capsid הוא קריטי עבור הידבקות ב-HIV-1. HIV-1 uncoating כבר קשה ללמוד בשל היעדר זמינות של מבחני רגיש ואמין עבור תהליך זה. כאן אנו מתארים שיטה כמותית ללימוד uncoating במבחנה באמצעות ליבות מבודד HIV-1 חלקיקים זיהומיות. גישה כוללת הבידוד של ליבות על ידי שקיעה של virions מרוכזת באמצעות שכבה של חומר הניקוי לתוך מפל סוכרוז ליניארי, בקור. כדי לכמת uncoating, גרעינים המבודד מודגרת ב 37 מעלות במרווחים מתוזמנים שונים pelleted לאחר מכן על ידי ultracentrifugation. היקף uncoating מנותח על ידי לכימות שבריר של CA ב supernatant. גישה זו כבר מועסק על מנת לנתח את ההשפעות של מוטציות ויראליות על יציבות HIV-1 capsid ^{4, 5, 6.} זה צריך להיות שימושית גם עבור לומד את התפקיד של גורמים הסלולר uncoating-HIV-1.

פרוטוקול

1. הפקה של HIV-1 חלקיקים

לפני שתמשיך, אתה חייב לקבל אישור ובצע את ההנחיות ממשרד biosafety של המוסד שלך לעבוד במתקן biosafety אישר ל-HIV זיהומיות. עליך להבטיח כי טיפול נאות אמצעי בטיחות הם אחריו במהלך העבודה במעבדה biosafety.

הפקה של HIV-1 החלקיקים מתבצע בדרך כלל על ידי transfection חולף של תאים 293T עם DNA-HIV-1 proviral בעזרת סידן פוספט transfection השיטה ^{7, 8.} כייל הנגיף גבוהה במניות גדל בתרבות של תאים T נגועים גם הם מתאימים.

דיון

השיטה המתוארת כאן כדי לטהר HIV-1 ליבות ללמוד uncoating במבחנה שימושי ללמוד את השלב הזה של מחזור HIV-1 החיים, בעיקר בשל חוסר זמינות של שיטה לנתח תוקף HIV-1 uncoating בתאי המטרה. אמנם שיטה זו משתמשת ultracentrifugation שיווי משקל לטהר ליבות, אחרים השתמשו pelleting ישיר לאחר תמוגה קצרה עם 1% טריטון ^{X-100-12, 13} או pelleting באמצעות כרית סוכרוז ועליהן 0.1% טריטון ^{X-100-14, 15.}

ההתאוששות של ליבות.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוג	הערות (אופציונלי)
DMEM	Cellgro	10-013-CV
PBS	Cellgro	21-031-CV
Triton-X-100	Mallinckrodt בייקר Inc	9002-93-1
Tween 20	Acros	9005-64-5
0.25% טריפסין-EDTA	Cellgro	25-053-CI
2XBBS			הרכב: 50mm BES [p H 6.95], 280 mM NaCl ו - 1.5 mM Na 2 HPO 4. התאם את ה-pH 6.95בטמפרטורת החדר. סנן לעקר & חנות aliquots ב -20 ° C.
נוגדן ציפוי: נוגדן חד שבטי כדי p24 (183-H12-5C)	NIH האיידס מחקר תוכנית הפניה מגיב	3537
הנוגדן העיקרי: HIV-איג (המטופל hyperimmune בסרום אדם)	NIH מחקר האיידס ו מגיב הפניה תוכנית	3957
משני הנוגדנים: אנטי אנושי עיזים IgG, peroxidase מצומדות	לנקב	31130
HRP המצע	KPL Inc	50-76-11
Immulon 2HB 96 צלחות טוב	Thermo Scientific	3455
SW32Ti ו SW32.1 הרוטורים טי ו ultracentrifuge תואם	Beckman Coulter
TLA-55 הרוטור ultracentrifuge השולחן	Beckman Coulter
מהירות גבוהה microfuge צינורות	Beckman Coulter	326823, 358123, 357448
Auto-Densi צפיפות זרם שיפוע fractionator	Labconco קורפ	4517000
צבע לשעבר	הלשכה המרכזית לסטטיסטיקה מדעי ושות בע"מ	GM-20