הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

התגובות הדמיה העצבית ההכנות Slice של איברים Vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית

10.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/3404

⸱

6 בדצמבר 2011

 ,  ,  ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Anatomy and Cell Biology, The University of Kansas School of Medicine

במאמר זה

סיכום

האיבר הוומרו-נזלי (VNO) מזהה אותות כימיים בתוך-מיניים המעבירים מידע חברתי ורבייתי. ביצענו ניסויי דימוי Ca2+ באמצעות עכברים טרנסגניים המבטאים G-CaMP2 ברקמת ה-VNO. גישה זו מאפשרת לנו לנתח את דפוסי התגובה המורכבים של נוירוני הוומרו-נזל למספר רב של גירויי פרומונים.

תקציר

האיבר הוומרונזלי (VNO) מזהה אותות כימותרמיים הנושאים מידע על המעמד החברתי, המיני והרבייתי של פרטים מאותו מין 1,2. אותות תוך-מיניים אלו, הפרומונים, כמו גם אותות מטורפים מסוימים 3, מפעילים את הנוירונים החושיים הוומרונזליים (VSNs) ברמות גבוהות של ספציפיות ורגישות 4. לפחות שלוש משפחות נפרדות של קולטנים המצומדים לחלבון G, ‏V1R, V2R ו-FPR 5-14, מתבטאות בנוירוני ה-VNO כדי לתווך את הזיהוי של הרמזים הכימותרמיים. כדי להבין כיצד מידע על פרומונים מקודד על ידי ה-VNO, חיוני לנתח את פרופילי התגובה של VSNs בודדים לגירויים שונים ולזהות את הקולטנים הספציפיים המתווכים תגובות אלו.

הנוירואפיתל של ה-VNO סגור בתוך זוג עצמות וומר. למבנה הצינורי חסר הראייה של ה-VNO יש קצה פתוח אחד (תעלת הוומרונזל) המתחברת לחלל האף. תאי VSN שלוחים את הדנדריטים שלהם לחלק הלומן של ה-VNO, שם סימני הפרומונים באים במגע עם הרספטורים המבוטאים בבליטות הדנדריטיות. גופי התא של ה-VSN יוצרים שכבות פסאודו-סטרטפייד, כאשר V1R ו-V2R מבוטאים בשכבות האפיקליות והבזאליות בהתאמה 6-8. מספר טכניקות שימשו לניטור תגובות של VSN לגירויים תחושתיים 4,12,15-19. בין טכניקות אלו, הכנת פרוסות אקוטיות מציעה מספר יתרונות. ראשית, בהשוואה ל-VSN מנותקים 3,17, הכנות של פרוסות שומרות על הנוירונים במורפולוגיה המקורית שלהם והדנדריטים של התאים נשארים שלמים יחסית. שנית, גופי התא של ה-VSN נגישים בקלות בפרוסה קורונלית של ה-VNO, מה שמאפשר מחקרי אלקטרופיזיולוגיה וניסויי דימיון בהשוואה לאפיתל שלם ולהכנות whole-mount 12,20. שלישית, ניתן לשלב שיטה זו עם טכניקות של שיבוט מולקולרי כדי לאפשר זיהוי רספטורים.

גירוי חושי מעורר זרימה חזקה של Ca2+ לתוך VSNs, המעידה על הפעלת רצפטורים 4,21. לפיכך, פיתחנו עכברים טרנסגניים המבטאים G-CaMP2 בנוירונים החושיים הריחוניים, כולל ה-VSNs 15,22. הרגישות והטבע הגנטי של הגשוש מקלים מאוד על ניסויי דימות Ca2+. שיטה זו ביטלה את תהליך טעינת הצבע ששימש במחקרים קודמים 4,21. כמו כן, אנו משתמשים במערכת להגשת ליגנדים המאפשרת יישום של גירויים שונים על פרוסות VNO. השילוב של שתי הטכניקות מאפשר לנו לנטר מספר נוירונים בו-זמנית בתגובה למספר רב של גירויים. לבסוף, הקמנו צינור ניתוח חצי-אוטומטי לסיוע בעיבוד התמונות.

פרוטוקול

1. הכנת תמיסות

  1. הכינו תמיסות 10X R1, 10X R2 ו-10X R3 בהתאם לטבלה.
    R1
    כימיקליםMW(g/mol)mM (1X)מלאי 10X (g/L)
    NaCl58.4412573.05
    KCl74.552.51.86
    MgCl21 M stock110 ml
    CaCl2·2H2O147.0222.94
    NaH2PO4·H2O137.991.251.72

    R2
    כימיקלMW(g/mol)mM (1X)מלאי 10X (g/L)
    NaHCO384.012521

    R3
    כימיקליםMW(g/mol)mM (1X)מלאי 10X (g/L)
    NaCl58.4412573.05
    KCl74.552.51.86
    MgCl21 M stock220 ml
    CaCl2·2H2O147.0222.94
    HEPES1 M stock550 ml
  2. הכינו 1 ליטר של נוזל חוטra שכיחתי מלאכותי לעכבר (mACSF) ביום הניסוי על ידי ערבוב של 100 ml של 10X R1 ו-100 ml של 10X R2 במים מזוקקים פעמיים (DDW), והוסיפו 1.8 g של דקסטרוז (ריכוז סופי 10 mM). שיטה זו למסבירה מונעת שקיעת סידן קרבונט ב-pH גבוה. האוסמולריות של mACSF היא סביב 310-315 mOsm/L. התאימו את האוסמולריות בעזרת דקסטרוז או מים במידת הצורך. הארירו את התמיסה עם גז Carboxygen (95% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני) למשך 30 דקות לפחות לפני התאמת ה-pH של התמיסה ל-7.2-7.4.
  3. הכינו 1 ליטר של תמיסת ריינגר (Ringer's solution) ביום הניסוי על ידי ערבוב של 100 ml של 10X R2 ו-100 ml של 10X R3 ב-DDW, והוסיפו 1.8 g של דקסטרוז (10 mM). האוסמולריות וה-pH של תמיסת ריינגר צריכים להיות דומים לאלה של mACSF. הארירו את התמיסה עם גז Carboxygen.
  4. הכינו אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה (LMA) בריכוז 4% ב-mACSF או בתמיסת ריינגר. חלקו את האגרוז המומס למשקוליות (aliquots) באנבובי אפנדורף ושמרו בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש. LMA, המורכב מפוליסכריד מpurified, נשאר נוזלי ב-37°C ומתמצק במהירות בטמפרטורה הנמוכה מ-25°C. תכונות אלו הופכות אותו לאידיאלי לקיבוע של VNO ולפיזיולוגיה של רקמות חיות. חומרים שאינם טהורים, כגון אגאר, אינם מומלצים לניסויים ברקמות חיות שכן רכיבים לא מאופיינים עלולים להפריע לתגובה העצבית.
  5. הכינו גירויי פרומון בתמיסת ריינגר. עבור שתן עכבר, דילול של 1:100 יביא לתגובות חזקות.

2. הכנת פרוסת VNO

  1. לפני הקרבת בעל החיים, הניחו שתי מבחנות של LMA על בלוק חימום וכוון את הטמפרטורה ל->60°C כדי להמיס את האגרוז. ברגע שהג'ל הופך לנוזלי, העבירו את המבחנות לבלוק חימום של 37°C.
  2. בצעו דקפיטציה לעכבר G-CaMP2 לאחר הרדמה ב-CO2. גזרו את עצמות הלסת התחתונה בעזרת מספריים כדי להסירה. קלפו את רקמת החיך העליונה כדי לחשוף את חלל האף (איור 1A). הפרידו את עצמות הלסת על ידי החלקת להב ניתוחי בין שתי השיניים הקדמיות. הסירו בזהירות את עצמות הלסת כדי לחשוף את ה-VNO. בשלב זה, ניתן להרים את ה-VNO כולו מחלל האף על ידי אחיזה בעצם הזנב (איור 1B). העבירו את ה-VNO באופן מיידי לתמיסות mACSF קרה ומחמצנת.
  3. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הפרידו בין שני ה-VNOs על ידי החלקת קצה פינצטה מסוג #5 בעדינות לאורך דופן עצם המחיצה (איור 1C). קלפו את עצם ה-vomer העוטפת את רקמת ה-VNO. הרימו בעדינות את כל רקמת ה-VNO מחלל העצם. יש לנקוט זהירות מרבית בשלב זה כדי לא לפגוע ב-neuroepithelium. יש להסיר לחלוטין שברי עצם קטנים שנותרו על פני השטח של הרקמה לפני ההטמעה. שברים שנותרו על הרקמה עלולים להיתפס בלהב החיתוך ולמשוך את הרקמה מתוך בלוק האגרוז.
  4. השתמשו בפינצטה כדי להחזיק את הקצה האחורי של רקמת ה-VNO והטביעו אותה בעדינות באגרוז המומס (איור 1D). קררו במהירות את המבחנה על קרח כדי להקשות את האגרוז. תהליך ההטמעה והקירור צריך להימשך פחות מ-2 דקות.
  5. לביצוע החתכים השתמשו בקוצץ רקמות VF300 (Precisionary Instruments, Greenville, NC). גזרו את בלוק האגרוז המכיל את ה-VNO לצורה המתאימה והדביקו אותו למחזיק הרקמה (איורים 1E ו-F). הכניסו את מחזיק הרקמה לתוך הגליל המתכתי ומלאו את החלל הנותר ב-LMA נוסף. ברגע שה-LMA התקשה על קרח, עברו מיד לשלב החיתוך. אספקו mACSF קרה ומחמצנת לתא החיתוך והתחילו לחתוך בעובי של 180-200 μm לכל פרוסה. התאימו את מהירות ההקדמה ואת תדר הרעידה כך שהרקמה לא תידחס במהלך החיתוך ושה-VNO לא ייפול מהאגרוז. אספו והעבירו את הפרוסות החתוכות לתא אינקובציה של mACSF (איור 2A). הפרוסות נשארות חיות למשך 6-8 שעות ב-mACSF מחמצנת בטמפרטורת החדר. איורים 2B ו-C מציגים תמונות DIC ותמונות 2-photon של פרוסת VNO מעכבר G-CaMP2, בהתאמה.

3. הגדרת תא הדמיון

  1. הניחו את פרוסת ה-VNO במרכז תא הפרפוזיה (Siskiyou, Grants Pass, OR) וקבעו את הפרוסה באמצעות מעגן פרוסות (Warner Instruments, Hamden, CT) (איור 3A). החוטים של המעגן צריכים ללחוץ רק על חלק ה-LMA של הפרוסה ולא על רקמת ה-VNO. mACSF מחומצן מועבר לתא הפרפוזיה דרך פתח הכניסה בקצב של כ-100 μl/sec והנוזל מנוקז באמצעות מחט שאיבה דרך פתח היציאה כדי לספק זרימה רציפה של mACSF טרי (איורים 3A ו-B).
  2. מלאו מזרק של 30 ml בתמיסת Ringer's וחבקו אותו למשאבת מזרקים (New Era Pump Systems, Farmingdale, NY). הגדירו את מהירות המשאבה ל-300-600 μl/min כדי לספק זרימה רציפה של תמיסת Ringer's מעל הפרוסה (איור 3C).
  3. חברו את מוצא תמיסת ה-Ringer's ללולאת הזרקה של HPLC (Chromtech, Apple Valley, MN) (איור 3D). ניתן לבחור גודל לולאה שונה לשם בקרה מדויקת על הנפח המועבר. בניסויים שלנו אנו משתמשים בלולאה של 20 μl. לבקרת לולאת ההזרקה יש שני נתיבי זרימה (איור 3E). במצב "טעינה" (load), ניתן להטעין דגימות ללולאת הדגימה באמצעות מזרק דיוק של Hamilton. דגימה עודפת יוצאת מלולאת הדגימה דרך פתח הפסולת. תמיסת Ringer's המוזרקת על ידי משאבת המזרקים עוקפת את לולאת הדגימה ועוברת ישירות למוצא, המחובר לקצה הפרפוזיה (איורים 3A ו-E). במצב "הזרקה" (injection), תמיסת המשאבה זורמת דרך לולאת הדגימה ודוחפת את התמריצים אל המוצא (איור 3E). לפני ניסוי הדימיג', יש להוציא בועות אוויר כדי להבטיח זרימה חלקה של נוזל הפרפוזיה. ניתן להשתמש גם במערכות הזרקה מסחריות אחרות או כאלה שהיוצרו בהתאמה אישית להעברת התמריץ.
  4. כווננו את קצה הפרפוזיה תחת עדשת 5X או 10X כך שהקצה יהיה במרחק של כ-1 mm מפרוסת ה-VNO.
  5. בעת הקמה של מערכת פרפוזיה חדשה, מומלץ למדוד את זמן השיהוי ומשך זמן הדגימה באמצעות צבע פלואורסצנטי. העמיסו צבע rhodamine 6G בריכוז 0.1% לתוך לולאת הדגימה והעבירו את השסתום למצב הזרקה 5 שניות לאחר תחילת רכישת התמונה (איור 3F). האות הפלואורסצנטי מזוהה בין 10-30 שניות. העקומה החלקה של האות הפלואורסצנטי מעידה גם על כך שנוצרה טרבולנציה מועטה תחת העדשה הטבולה וכי פרפוזיה נאותה של mACSF מחומצן מגיעה לפרוסה.

4. דימוג במרווחי זמן (Time lapse imaging)

  1. אנו משתמשים במיקרוסקופ Zeiss AxioSkope FS2 עם עדשת טבילה במים (water-dipping) של 10X או 20X לצילום במרווחי זמן (time lapse). פילטר bandpass סטנדרטי ל-GFP ‏(450-490nm) משמש לזיהוי אותות G-CaMP2. תצלומי האפי-פלואורסצנציה נרכשים באמצעות מצלמת CCD‏ (Zeiss HRM) עם binning של 1X1 או 2x2, בהתאם לרמות הביטוי של G-CaMP2.
  2. הגדירו את מהירות הרכישה ל-1 פריים לשנייה. התאימו את עוצמת האור כדי למזער את הדהייה (bleaching) של אותות ה-G-CaMP2 ונזק פוטו-כימי לתאים. עבור כל ניסוי, אנו גובים בדרך כלל מחסנית תמונות של 60 פריימים (כ-60-70 שניות). העבירו את השסתום למצב הזרקה בנקודת זמן ספציפית (למשל, בשנייה ה-5 ב-Figure 3F) עבור סט ניסויים אחד, כדי להשיג השהיית זמן עקבית בכל החזרות.
  3. בצעו הרצת בדיקה באמצעות תמיסת Ringer כגירוי. התאימו מחדש את מערך הפרפוזיה אם נוצר ארטיפקט של תנועה במהלך הזרקת הדגימה.
  4. בצעו הרצת ביקורת חיובית עם שתן עכבר המדולל ביחס של 1:100 בתמיסת Ringer. ערך ה-ΔF/F המקסימלי הטיפוסי של תגובת G-CaMP2 לשתן עכבר הוא סביב 20-40%. במידת הצורך, ניתן לאשר את חיוניות הפרוסה על ידי מתן 10 mM KCl בתמיסת Ringer כדי לגרות את הפרוסות בסיום הניסויים.
  5. שטפו את מזרק ההמילטון (Hamilton syringe) בתמיסת Ringer לפחות שלוש פעמים לאחר טעינת גירוי אחד. שטפו את לולאת הדגימה (sample loop) בתמיסת Ringer לפחות שלוש פעמים בין גירויים שונים. שלבים אלו מונעים זיהום צולב בין דגימות שונות.
  6. המתינו 4-10 דקות להתאוששות ה-VSNs לפני החלת הגירוי הבא.

5. ניתוח נתונים

  1. בצעו רישום תמונה (image registration) לכל התמונות שנרכשו מפרוסה אחת. אנו משתמשים בסקריפט VBA שנכתב באופן מותאם אישית ב-AxioVision (Carl Zeiss, North America) כדי להפוך תהליך זה לאוטומטי. כל פריימי התמונה באותו ניסוי נרשמים ביחס לפריימיי רפרנס משותף שנבחר באמצעות רישום אלסטי (איור 4A). רישום אלסטי, הידוע גם כרישום לא ליניארי, הוא קטגוריה של טכניקת רישום תמונה המדגישה התמרה לא קשיחה של תמונת מטרה לתמונת רפרנס. כאן השתמשנו במימוש מ-AxioVision.

    פריימיי רפרנס זה נבחר באופן שרירותי מתוך ערימות התמונות.
  2. בצעו חיסור תמונות כדי לזהות את התאים המגיבים. אנו משתמשים במקרוים שנכתבו באופן מותאם אישית ב-ImageJ v1.42 (http://rsb.info.nih.gov/ij/, NIH, Bethesda, MD) כדי להפוך תהליך זה לאוטומטי. תמונת השלכה מינימלית (minimal projection image) נוצרת עבור כל ערימה. תאים מגיבים מופיעים לאחר שביצעו חיסור של ההשלכה המינימלית מהערימות הגולמיות (איור 4B).
  3. זהו את אזור העניין (ROI) מהערימות שחושבו וקבלו את קואורדינטות ה-ROI באמצעות תוסף Multi-Measure מ-ImageJ. עבדו את כל הערימות עבור ניסוי אחד ושמרו את כל קואורדינטות ה-ROI ברשימת ROI ראשית (איור 4C).
  4. השתמשו ברשימת ה-ROI הראשית כדי למדוד תגובות תאים מערימות תמונות גולמיות באמצעות מקרו שנכתב באופן מותאם אישית ותוסף Multi-Measure מ-ImageJ (איור 4D). שרטטו עקומות תגובה ומפת חום ב-Matlab (Mathworks Inc., Natick, MA).

6. תוצאות מייצגות

דוגמה לניסוי דימות של VNO באמצעות דגימות שתן שנאספו מארבעה עכברים בודדים מוצגת ב- איור 5הפרוסה מגיבה לגירוי שתן באמצעות דפוסי הפעלה מגוונים. זוהו כ-80 תאים שהראו תגובה לפחות לאחד מגירויי השתן, וערכי ה-ΔF/F של תגובתם מופיעים במפת החום (איור 5A). עקומות התגובה של תאים 1, 2 ו-3 מוצגות ב- איור 5B המראים את מהלך הפעלה על ידי גירויי שתן. תא 1 מציג תגובה לשתי דגימות השתן הנשיות אך לא לדגימות הגבריות, בעוד שתא 2 מראה דפוסי הפעלה הפוכים ומגיב לשתי הדגימות הגבריות בלבד. תא 3 מופעל הן על ידי דגימות גבריות והן על ידי דגימות נשיות בודדות. תאים 1 ו-2 מראים תגובה אופיינית לרמזים ספציפיים למין בשתן. 15.

ניתוח של האיבר הוומרונזלי (VNO), דיאגרמות אנטומיות, הגדרת ציוד לניתוח חושי.
איור 1 איור סכמטי של תהליך ניתוח ה-VNO. A. המיקום האנטומי של ה-VNO בראש העכבר. ראשו של עכבר G-CaMP2 נותח והונח הפוך, כאשר הרקמה הרכה הוסרה מהחך כדי לחשוף את ה-VNO. התמונה המוקטנת מראה תמונה פלואורסצנטית של אותה תמונה. הנוירואפיתל של ה-VNO מופיע בירוק בהיר. B. מבט מהצד של VNO מבודד המוקף בעצם הוומר (למעלה) והתמונה הפלואורסצנטית של אותו VNO (למטה). C. מבט קורונלי של ה-VNO ותהליך הניתוח. VNO אחד מופרד מהמחיצה ואז ניתן להסיר את עצם הוומר כדי לשחרר את הנוירואפיתל. D. VNO מוטמע ב-LMA. E. הבלוק המוטמע מודבק למחזיק הרקמה לצורך חיתוך. מחזיק הרקמה מקודם ב-180-200 μm לכל פרוסה, מה שדוחף את בלוק האגרוז אל מחוץ לחבית המתכת לצורך החיתוך. להב החיתוך ממוקם קרוב לחבית המתכת. F. מבט מהצד של מערכת חיתוך הרקמות VF300. B.V., כלי דם. N.E., נוירואפיתל.

א. הגדרת מיקרוסקופ עם כיוונונים אופטיים לצורך דימות; ב, ג. תמונות מיקרוסקופיות של דגימות ביולוגיות.
איור 2 פרוסות VNO. א. פרוסות של ה-VNO נשמרות ב-mACSF מחומצן בטמפרטורת החדר. ב. תמונת DIC של פרוסת ה-VNO. ג'. דימוי בשיטת 2-פוטונים של ה-VNO מעכבר G-CaMP2. סרגל קנה מידה, 50 μm.

הגדרת פרפוזיית VNO, משאבת מזרק ודיאגרמת שיטת כרומטוגרפיה עם גרף תוצאות נתונים.
איור 3 הדגמה של הגדרת מערכת הפרפוזיה. A. תא פרפוזיה טיפוסי עם כניסה ויציאה. פרוסת VNO ממוקמת במרכז התא ומונמכת באמצעות מעגן רקמות. ההברגות המרכזיות מוסרות מהמעגן כדי שרקמת ה-VNO לא תידחס. B. תא הפרפוזיה מונח על בסיס המיקרוסקופ תחת עדשת טבילה. כניסת ה-mACSF, יציאת השאיבה וקצה הפרפוזיה מסומנים. C. משאבת מזרק בעלת חבית אחת מספקת זרימה רציפה של Ringer's דרך קצה הפרפוזיה. D. מערכת לולאת הזרקה של HPLC אומצה לצורך טעינה והזרקה נוחות של דגימת הגירוי. E. איור סכמטי של כיווני הזרימה במיקומי הטעינה וההזרקה. Ringer's, בירוק. דגימת גירוי, במגנטה. החיצים מצביעים על כיוון הזרימה. F. מדידת זמן השהיה וזמן שטיפה של מערכת הפרפוזיה. צבע פלואורסצנטי Rhodamine 6G נטען ללולאת הדגימה והשסתום מועבר למיקום ההזרקה בשנייה ה-5, המסומנת בחץ. שינוי באות הפלואורסצנציה מזוהה בין השניות 10-30 ונחלש לאחר מכן.

רישום תמונות ועיבוד ROI במיקרוסקופיה עם ניתוח תגובת גירוי וסקירה כללית של סט הנתונים.
איור 4 שלב עיבוד התמונות. A. כל פריימי התמונה עבור פרוסה אחת נרשמים ביחס לפריים ייחוס. B. חיסור של השלכה מינימלית של ערימה מהפריימים הגולמיים שלה. תאים מגיבים הופכים בולטים לאחר החיסור. C. בחירת ROIs וריכוז הקואורדינטות שלהם לרשימה ראשית. D. מדידה של תאים מגיבים באמצעות רשימת ה-ROI הראשית מהערימה הגולמית.

מפת חום וגרפים קוויים המראים ניתוח ΔF/F; השוואת נתונים של FVB, CBA, BL6 על פעילות עצבית.
איור 5 ניסוי הדמיה נציג של G-CaMP2 ב-VNO. A. מפת חום של תגובת ΔF/F מפרוסה שעוררה באמצעות שתן של זכר ונקבה בודדים. דגימות שתן נאספו מעכברים זכרים ונקבות בודדים. ציר ה-X: תאים מגיבים שזוהו מהפרוסה. ציר ה-Y: דגימות שתן ששימשו בניסוי. סרגל הצבעים מציין את ערך ה-ΔF/F. B. מהלך זמן התגובה של 3 תאים נציגים המסומנים ב-A. החצים מציינים את זמן יישום הגירוי. F-FVB: נקבת FVB; F-CBA: נקבת CBA; M-FVB: זכר FVB; M-BL6: זכר C57BL/6.

טבלה של ריאגנטים וציוד ספציפיים:

שם הרכיב חברה מספר קטלוגי הערות (אופציונלי)
תא פרפוזיהSiskiyouPC-Hאופקי
מחזיק פרוסות (slice hold-down)Warner InstrumentsSHD-22CL 
מחזיק פתחי פרפוזיהALA scientific, Inc.MPIOH-S 
משאבת מזרקיםNew Era Pump Systems, Inc.NE-300 
שסתום הזרקה בלחץ נמוךChromtechV-451 
צינור PEEKChromtech15311/16" OD, 0.25mm ID
לולאת דגימה מ-PEEKChromtech180320 μL
מזרק HamiltonChromtech80630100 μL

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מרבית הקולטנים הוומרונזאליים (VRs) נותרו כקולטנים יתומים מאז גילו על ידי Dulac ו-Axel 5. הליגנדים הפרומונליים עבור קולטנים כימוסנסוריים אלו ותפקידם בתיווך התנהגויות של בעלי חיים אינם מובנים היטב. עד כה, רק זוג אחד של ליגנד/קולטן, הפפטיד ESP1 והקולטן התואם לו, Vmn2r116 (V2Rp5), זוהה והוכח כמעביר מידע חברתי ספציפי 19,23. קולטן נוסף, V1rb2, הוכח כמגיב ל-2-heptanone, אשר ככל הנראה מרוכז בשתן של נקבות עכברים 24. עם זאת, המידע הספציפי המועבר על ידי ליגנד זה נותר לא ברור. השיטה שפיתחנו כאן מאפשר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא הוצהרו ניגודי עניינים.

תודות

אנו מודים לאנדריאה מוראן יחד עם חברי מתקן השירותים לבעלי חיים למעבדה (LASF) במכון סטואורס על תמיכתם המצוינת בגידול בעלי החיים ובשירותים הטכניים. עבודה זו נתמכת במימון ממכון סטואורס ומ-NIH (NIDCD 008003) עבור CRY. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכון הלאומי לחירשות ולהפרעות תקשורת אחרות או של המכונים הלאומיים לבריאות. פטנט בארה"ב ממתין עבור עכברי tetO-G-CaMP2 עבור מכון סטואורס, CRY ו-LM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

מקורות

  1. Birch, M. C. Pheromones. , North-Holland Pub. Co. & American Elsevier Pub. Co. (1974).
  2. Wyatt, T. D. Pheromones and animal behaviour : communication by smell and taste. , Cambridge University Press. (2003).
  3. Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs. Cell. 141, 692-703 (2010).
  4. Leinders-Zufall, T. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
  5. Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83, 195-206 (1995).
  6. Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90, 763-773 (1997).
  7. Matsunami, H., Buck, L. B. A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals. Cell. 90, 775-784 (1997).
  8. Ryba, N. J., Tirindelli, R. A new multigene family of putative pheromone receptors. Neuron. 19, 371-379 (1997).
  9. Pantages, E., Dulac, C. A novel family of candidate pheromone receptors in mammals. Neuron. 28, 835-845 (2000).
  10. Zhang, X., Rodriguez, I., Mombaerts, P., Firestein, S. Odorant and vomeronasal receptor genes in two mouse genome assemblies. Genomics. 83, 802-811 (2004).
  11. Liberles, S. D. Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).
  12. Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
  13. Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats. Genomics. 86, 306-315 (2005).
  14. Rodriguez, I., Punta, D. el, Rothman, K., Ishii, A., T,, Mombaerts, P. Multiple new and isolated families within the mouse superfamily of V1r vomeronasal receptors. Nat. Neurosci. 5, 134-140 (2002).
  15. He, J., Ma, L., Kim, S., Nakai, J., Yu, C. R. Encoding gender and individual information in the mouse vomeronasal organ. Science. 320, 535-538 (2008).
  16. Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli. Science. 289, 1569-1572 (2000).
  17. Chamero, P. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450, 899-902 (2007).
  18. Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
  19. Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437, 898-901 (2005).
  20. Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy. Neuron. 57, 661-672 (2008).
  21. Leinders-Zufall, T. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306, 1033-1037 (2004).
  22. He, J. Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).
  23. Haga, S. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466, 118-122 (2010).
  24. Boschat, C. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5, 1261-1262 (2002).
  25. Hendel, T. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in. 28, 7399-7411 (2008).
  26. Pologruto, T. A., Yasuda, R., Svoboda, K. Monitoring neural activity and [Ca2+] with genetically encoded Ca2+ indicators. J. Neurosci. 24, 9572-9579 (2004).
  27. Jayaraman, V., Laurent, G. Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies. Front Neural Circuits. 1 (3), (2007).
  28. Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

GCaMP2Time lapse
התגובות הדמיה העצבית ההכנות Slice של איברים Vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.