בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול תכנות מחדש יעיל של האדם התאים הסומטיים אל האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) באמצעות וקטורים retroviral קידוד Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו-c-myc (OSKM) וזיהוי של hiPSC לתכנות מחדש בצורה נכונה על ידי צביעה חיה עם Tra למוצרי 1-81 נוגדנים.

תקציר

במסמך זה אנו מציגים פרוטוקול של תכנות מחדש fibroblasts בוגרים האדם אל האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) באמצעות וקטורים retroviral קידוד Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו-c-myc (OSKM) בנוכחות סודיום בוטיראט ^1-3. השתמשנו בשיטה זו כדי לתכנת מחדש את המעבר מאוחר (> P10) fibroblasts בוגרים האדם הנגזרות של המטופל Friedreich אטקסיה (GM03665, Coriell Repository). הגישה תכנות מחדש כולל פרוטוקול התמרה היעילה ביותר באמצעות צנטריפוגה חוזרת של fibroblasts בנוכחות המכילים וירוסים התקשורת. המושבות hiPSC לתכנות מחדש זוהו באמצעות immunostaining חי עבור Tra-1-81, סמן פני השטח של תאים pluripotent, מופרד fibroblasts לא לתכנות מחדש ו passaged ידני ^4,5. HiPSC אלה הועברו לאחר מכן צלחות Matrigel וגדלה במזין נטולי תנאים, ישירות מהצלחת תכנות מחדש. החל מ במעבר 1, מושבות hiPSC להפגין מאפיין הס-lאייק המורפולוגיה. שימוש בפרוטוקול זה יותר מ 70% של מושבות שנבחרו ניתן להרחיב בהצלחה והקים את שורות תאים. הקווים hiPSC שהוקמו מוצג סמנים אופייניים pluripotency כולל סמנים פני השטח tra-1-60 ו SSEA-4, כמו גם סמנים גרעיני Oct3 / 4, ו Sox2 Nanog. הפרוטוקול המובא כאן הוקם ונבדק באמצעות fibroblasts בוגרים שהתקבלו מחולים אטקסיה של Friedreich ויחידים בקרת ^6, fibroblasts אדם שזה עתה נולדו, כמו גם קרטינוציטים אדם.

פרוטוקול

1. וירוס ייצור התמרה

1. צלחת הפניקס Ampho תאים בצפיפות של צלחת 10 ~ 7-8x10 ⁶ ס"מ לכל 10 מ"ל של DMEM בינוני (גלוקוז DMEM גבוהה, 10% FBS חום מומת, 2 מ"מ L-גלוטמין, ללא אנטיביוטיקה). מקום בחממה ותרבות לילה בשעה 37 ° C, 5% CO _2.
2. למחרת transfect הפניקס תאים באמצעות 12 מיקרוגרם של קידוד וקטורי או Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-myc, או GFP גן (Addgene פלסמידים 17217, 17218, 17219, 17220) ו 35 Fugene μl 6. להכין תערובת transfection ב μl של 500 DMEM בינוני (גלוקוז DMEM גבוהה, 2 מ"מ L-גלוטמין, לא FBS ואנטיביוטיקה). דגירה 20 דקות. בעדינות פיפטה מתחמי דנ"א לתוך צלחות 10 ס"מ המכיל 70-80% תאים confluent הפניקס.
3. החלף התקשורת 6-8 שעות שלאחר transfection עם DMEM בינוני (גלוקוז DMEM גבוהה, 10% FBS חום מומת, 2 מ"מ L-גלוטמין) המכיל פניצילין וסטרפטומיצין.
4. לאחר מכן, לאסוף וירוסים המכיל מדיה 4 פעמים ב 12 שעותבמרווחים, לשלב את כל החלקים ומסוננים באמצעות כמה 0.45 מיקרומטר סינון להסיר תאים משפחתיים ופסולת (מדיה המכילים חלקיקים נגיפיים אפשר לשמור במקרר במשך 2 שבועות מבלי לאבד את פעילות זיהומיות, אולם ההקפאה אינה מומלצת).
5. עבור retroviral, התמרה צלחת fibroblasts בוגרים האדם (מעבר 10, Coriell מעבדות) מ h קפוא המניה 24 שקדמו ליום האחרון של אוסף המדיה retroviral. זרעים התאים על 6 צלחות מכוסות היטב ג'לטין בבתי 1x10 צפיפות ⁵ תאים לכל גם ב DMEM גלוקוז גבוהה, 10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, פניצילין, סטרפטומיצין ולא חיוניות חומצות אמינו.
6. תחליף למחרת DMEM התקשורת עם התקשורת המכילים חלקיקים נגיפיים שהתקבלו תאים הפניקס. הוסף מדיה נגיפיים (1 מ"ל של כל אחד Oct4, Sox2, Klf4, ו-c-myc התקשורת, הכולל 4 מ"ל) השלימו עם 6 מיקרוגרם / מ"ל ​​של polybrene אל היטב בכל צלחת 6-גם של התרבויות פיברובלסטים ו צנטריפוגות ב 1600g עבור 1h על 20 ° C. כ 12 שעות AFter התמרה, להחליף את התקשורת ויראלי עם המדיום תרבות פיברובלסטים. בצע זיהום ויראלי צנטריפוגה 3 פעמים ב -24 מרווחי ש.
7. תרבות fibroblasts ב DMEM מדיה עבור H 48 לאחר ההדבקה האחרונות. יש לבדוק את היעילות של זיהום על ידי transductions מקבילים עם מדיה retroviral המבטאים GFP. איור 1 מדגים את היעילות של זיהום צנטריפוגה הקל retroviral של פיברובלסטים האדם.

2. תכנות מחדש

1. הכן 6 צלחות גם עם γ-מוקרן שכבות מזין MEF ידי זריעת תאים MEF בצפיפות של ~ 2x10 ⁵ תאים לכל היטב את הג'לטין טיפול 6 צלחת גם במדיום גידול פיברובלסטים. למחרת לפצל fibroblasts אדם שנדבקו באמצעות 0.05% טריפסין / EDTA וזרעי אותם בצפיפות של 1.2x10 ~ ⁴ לכל גם במדיום fibroblasts הצמיחה.
2. למחרת להחליף את התקשורת עם הס התקשורת (DMEM/F12, 20% סרום נוק תחליף, לא חיוניות חומצות אמינו, penicillin / סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין, 0.1 מ"מ β-mercaptoethanol, 20 ng / ml הצמיחה הבסיסי פיברובלסטים פקטור (bFGF), השלימו עם בוטיראט 0.5 מ"מ נתרן ל -7 הימים הראשונים של תכנות מחדש. לשנות את התקשורת מדי יום.
3. לעקוב אחר שינויים מורפולוגיים בתאים transduced מדי יום. מושבות של הירכיים דמויי תאים יתחיל לצאת כ 5 - 10 ימים לאחר העברת fibroblasts transduced על גבי תאים מזין. המושבות hiPSC מוכנים לבודד כ 14 - 28 ימים לאחר ציפוי אותם על התאים מזין MEF.

3. הבידוד של hiPSC המושבות

1. יום לפני בחירת המושבות hiPSC להכין 24 גם צלחות עם γ-מוקרן מזין תאים MEF (~ ⁴ 4x10 תאים בכל טוב) במצע גידול fibroblasts. בשלב זה מושבות hiPSC יכול גם להעביר את התרבות מזין בחינם באמצעות Matrigel ובינוניים mTeSR1.
2. לפני בידוד של מושבות hiPSC להכין צלחות MEF על ידי הסרת הגידול fibroblasts mediuמ 'ושטיפה MEFs עם PBS להסיר עקבות של FBS. לאחר מכן מוסיפים 0.5 מ"ל הס בינוני (או mTeSR1 בינוני במקרה של בארות מצופה Matrigel) עם מעכב 10 מיקרומטר רוק Y27632 זה ^7,8 היטב.
3. במידת הצורך, להסיר את fibroblasts סביב המושבות hiPSC עם מחט 21 מד תחת מיקרוסקופ רכוב בשכונה למינרית הזרימה (איור 2 א - ג). יש לשטוף את הצלחות עם PBS ולהוסיף טריים התקשורת הס המכיל נוגדנים ספציפיים Tra-1-81 StainAlive (1:200, Stemgent). אחרי 30 דקות., החלף מדיה המכילה את הנוגדן עם טריים התקשורת הס השלימו עם מעכב רוק 10 מיקרומטר. לבחון את הצלחות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומארק Tra-1-81 מושבות חיוביים באמצעות סמן אובייקטיבי (איור 2 ד).
4. חותכים את Tra-1-81 מושבות hiPSC חיוביים תחת המיקרוסקופ של מכסה המנוע למינרית, לחתיכות קטנות כמה באמצעות מחט מד 21 כפי שמוצג באיור 2E ופ
5. שימוש אוטומטי פיפטה (P200) שברי העברה של מושבות hiPSC אל תעשבארות ividual של צלחת 24 גם עם MEFs או Matrigel. למנוע העברת שאינם הירכיים תאים. מניחים את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור ולאפשר המושבות hiPSC לצרף עבור 24-36 שעות.
6. שינוי הס או mTeSR1 (על מושבות על מצע של Matrigel) התקשורת מדי יום. המושבות hiPSC עם מורפולוגיה הס דמוי נכונה ניתן יהיה לראות 48 שעות לאחר ההעברה הראשונית לצלחת של 24 באר.
7. מעבר ידני hiPSC מושבות כל 6 - 8 ימים על גבי 12-היטב ולאחר מכן על צלחת 6 היטב.
8. לאחר הרחבת משובט והקמת קווי hiPSC, לנתח ביטוי של סמנים pluripotency tra-1-60, SSEA-4, Oct3 / 4, ו Sox2 Nanog באמצעות immunocytochemistry כפי שמוצג באיור 3. להעריך את תקינות הגנומי ובפוטנציאל בידול של קווי להשיג באמצעות קריוטיפ היווצרות תפלצת רוחנית ניתוח ^6,9.

4. נציג תוצאות

התמרה יעיל עם רטרווירוס המכיל התקשורת אניזה קריטי עבור תכנות מחדש מוצלחת. מומלץ לבצע את ההליך כולו transfection / זיהום באמצעות GFP להביע וירוס בכל ניסוי תכנות מחדש אחת כדי לפקח על יעילות כפי שמוצג באיור 1. כייל של וירוס ה-GFP להביע נקבע, כמתואר ^10, דרך התמרה של fibroblasts האדם באמצעות המדיה שאינם מרוכזים ויראלי היה בדרך כלל בטווח של 0.5-5 x 10 ^-7 חלקיקים נגיפיים לכל מ"ל (סמנכ"ל / ml).

Fibroblasts לשנות את המורפולוגיה כבר 2 ימים לאחר ההדבקה האחרון. Fibroblasts אדם Trypsinized יש לספור היטב לפני זריעת אותם על התאים מזין MEF. מומלץ לתאי זרע לאחר 3 צפיפויות שונות (6x10 ^3, 1.2x10 ^4, 2.5x10 ⁴ לכל אחד גם צלחת גם 6) מאז כל שורה תא מדגים מאפיין צמיחה שונה וצפיפות זריעת הוא קריטי ליעילות של תכנות מחדש. סודיום בוטיראט המשמשראשוני 7 - 14 ימים של תכנות מחדש מגביר את היעילות של היווצרות hiPSC כ 5 פי. לעתים קרובות, במיוחד כאשר fibroblasts נגועים היו זרע בצפיפות גבוהה יותר, דמויי תאים פיברובלסטים יכול לגדול יותר מאכל תרבות לכסות מושבות hiPSC כפי שמוצג באיור 2 א. במקרה זה, שכבת פיברובלסטים ניתן הרים בזהירות להסיר לחשוף מושבות hiPSC (איור 2 ב). לאחר מכן, מושבות hiPSC יש לשטוף עם הס מדיה מוכתם נוגדנים Tra-1-81. בהתאם תאים פיברובלסטים, כ 20 - 40% של מושבות מפגינים עם מורפולוגיה iPSC כמו לא ללכלך עם נוגדנים Tra-1-81. מושבות hiPSC המזוהים ניתן להעביר מהצלחת בתוך 12 הבא - 24 שעות. דגירה ממושכת תגרום הבחנה מהירה של hiPSCs. מושבות ניתן passaged באופן ידני על גם בתאי מזין MEF או Matrigel מצופים צלחות. לאחר ההרחבה הוקמה שיבוטים hiPSC יש לבדוק באמצעות immunocytochemistry (ICC) לביטוי של pluripotenסי סמנים כמו הדגים באיור 3. בנוסף, אפיון מולקולארי מפורט של קווי שב"ס שנוצר התא צריכה לכלול: ניתוח ביטוי גנים pluripotency באמצעות RT-PCR, הפגנה של demethylation DNA על היזמים של גנים וניתוחים pluripotency של transgenes להשתקת ^9.

באיור 1. היעילות של התמרה ויראלית נקבע באמצעות רטרווירוס GFP להביע. (א, ב) fibroblasts בוגרים האדם הנגזרות של המטופל Friedreich אטקסיה (GM03665, Coriell Repository) היו דמיינו אחרי שתי דלקות רצופות עם התקשורת GFP retroviral. (C, D) fibroblasts אדם נדבקו אצווה זהה של התקשורת GFP retroviral ואחריו צנטריפוגה של תאים ישירות על 6 צלחות גם עבור 1h ב 1600g. תמונות נתפסו 48h לאחר ההדבקה.

איור 2. זיהוי ובידוד של מושבות hiPSC. (א) בניגוד שלב תמונה של צלחת המכילה hiPSCs מוקפים fibroblasts. התאים היו בתרבית במשך 21 ימים על הס התקשורת. (B, C) המושבה hiPSC אותו לאחר הסרת שכבת פיברובלסטים שמסביב. (ד) מושבות hiPSC לתכנות מחדש כראוי מזוהים מכתים חי עם נוגדנים Tra-1-81 פני דה מרקר, לחתוך באמצעות מחט סטרילית (E, F) והועברו בארות נפרדות של צלחת של 24 באר.

איור 3. הביטוי של סמנים ספציפיים pluripotency Oct3 / 4, Nanog, Sox2, SSEA4 ו Tra-1-60 hiPSCs נקבע על ידי immunocytochemistry.

דיון

לימוד מחלות אנושיות, נוירולוגיות ניווניות במיוחד, כבר מאתגר במיוחד בשל חוסר נגישות של מודלים מתאימים הסלולר אדם. היכולת לתכנת מחדש תאים סומטיים להשגה בקלות לתוך המושרה בתאי גזע pluripotent ואת הפוטנציאל להבדיל אותם סוגי תאים שונים נפתחה האפשרות ליצור דגמים סלולריים של מחלות גנטיות. בנוסף, iPSCs לקיים הבטחה גדולה לעתיד של רפואה רגנרטיבית. לכן, חשוב לפתח שיטות אופטימיזציה אמין, יעיל ובטוח של תכנות מחדש תאים סומטיים כדי pluripotency.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מגיב	חברה	מספר קטלוגי
DMEM	Invitrogen	11965
DMEM/F12	Invitrogen	11330
KSR	Invitrogen	10828
שאינם חיוניים aminoacids	Invitrogen	11140
סודיום בוטיראט	סיגמא	B5887
Y27632	Stemgent	04-0012
bFGF	Stemgent	03-0002
Tra-1-81 נוגדן	Stemgent	09-0069
Oct3 / 4 נוגדן	סנטה קרוז	SC-8628
Nanog נוגדן	התא איתות טכנולוגיה	4903S
Tra-1-60 נוגדן	Millipore	MAB4360
Sox2 נוגדן	התא איתות טכנולוגיה	3579S
SSEA4	Millipore	MAB4304
CF1 MEFs	Globalstem	GSC-6201G
המטרה סמן	ניקון	MBW10010
Matrigel	BD Biosciences	354277
mTeSR1	StemCell טכנולוגיות	05850
β-mercaptoethanol	סיגמא	M7522
Fugene 6	רוש	11814443001
polybrene	סיגמא	H9268
סמן אובייקט	ניקון	MBW10010