Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

סיכום

קינאז leucine חזור ריץ' 2 הוא קינאז multidomain גדול, מוטציות שהן הגורם הגנטי השכיח ביותר של מחלת פרקינסון. ניתוח של פעילות קינאז של החלבון הזה הוכיחה להיות כלי חיוני בהבנת הביולוגיה תפקוד של חלבון זה. במאמר זה, במבחנה Assaying פעילות קינאז של LRRK2 ומבחר מוטנטים שלה מתואר, המספקת מערכת הניסוי לבחון זירחון של מצעים המשוערת וכשל פוטנציאלי של LRRK2 במחלה.

תקציר

קינאז leucine חזור ריץ' 2 (LRRK2) הוא חבר 2527 חומצת אמינו המשפחה Roco של חלבונים, בעלת מבנה מורכב, multidomain כולל תחום GTPase (המכונה ROC, עבור ראס של חלבונים מורכבים) ואת תחום kinase ^1. הגילוי בשנת 2004 של מוטציות הגורמות LRRK2 מחלת הפרקינסון (PD) הביא LRRK2 להיות המוקד של נפח עצום של מחקר על תפקוד תקין שלה ואיך החלבון משתבש במצב מחלה ^2,3. חקירה ראשונית לתוך הפונקציה של LRRK2 התמקדה הפעילות האנזימטית שלו ^4-6. למרות תמונה ברורה טרם לצוץ של שינוי עקבי אלה עקב מוטציות, נתונים ממספר קבוצות הדגיש את החשיבות של פעילות קינאז של LRRK2 מוות של תאים המקושרים מוטציות ^7,8. פרסומים אחרונים מדווחים מעכבי מיקוד פעילות קינאז של LRRK2, מתן כלי ניסיוני מפתח ^9-11. לאור נתונים אלה,סביר להניח כי המאפיינים האנזימטית של LRRK2 להרשות לנו חלון חשוב לתוך הביולוגיה של חלבון זה, אף אם הם מטרות תרופה פוטנציאל פרקינסון פתוח לדיון.

מספר גישות שונות שימשו assay פעילות קינאז של LRRK2. בתחילה, מבחני בוצעו באמצעות חלבון מתויג epitope overexpressed שורות תאים יונקים immunoprecipitated, עם מבחני שבוצעו באמצעות חלבון משותקת על חרוזים agarose ^4,5,7. לאחר מכן, מטוהרים שברי רקומביננטי של LRRK2 בתמיסה יש גם שימש, למשל קטע GST מתויג מטוהרים מתאי חרקים המכיל שאריות 970-2527 של LRRK2 ^12. לאחרונה, דיווחו דניאלס et al. בידודה של LRRK2 באורך מלא בתמיסה של האדם תאים עובריים כליה, אך חלבון זה אינו זמין נרחב ^13. לעומת זאת, היתוך GST חתוכים בצורת LRRK2 הוא availabl מסחריתדואר (מ Invitrogen, ראה טבלה 1 לפרטים נוספים), והיא מספקת כלי נוח עבור הוכחת assay לפעילות LRRK2 קינאז. יציאות שונות על פעילות קינאז LRRK2 דווחו. Autophosphorylation של LRRK2 עצמו, זירחון של חלבון המיאלין הבסיסי (MBP) בתור מצע קינאז זירחון גנריים של מצע מלאכותי - LRRKtide המכונה, בהתבסס על זירחון של תראונין 558 ב Moesin - כל שימשו, כפי שיש בסדרה של מצעים פיזיולוגיים המשוערת כולל α-synuclein, Moesin ו 4-EBP ^14-17. מעמדו של החלבונים האלה כמו מצעים עבור LRRK2 עדיין לא ברור, וככזה פרוטוקול המתואר להלן יתמקד באמצעות MBP כמו מצע גנריות, וציין את תוכנית השירות של מערכת זו על פעילות קינאז LRRK2 assay כנגד מגוון רחב של מצעים פוטנציאליים.

פרוטוקול

בטיחות

פרוטוקול המתואר להלן מנצל ATP שכותרתו עם P ³² הרדיואקטיבי במיקום פוספט γ לעקוב אחר פעילות קינאז של LRRK2. הוא מבוסס על פרוטוקולים סטנדרטיים המשמשים במעבדה שלנו, וכך לגבי רבים מן השלבים בתהליך, כגון הפעלת ג'לים, המערבי סופג וכולי החומרים ותנאי מדויק צריך לקחת כמדריך כמו ציוד ופרוטוקולים משמש תהליכים אלה משתנה בין מעבדה למעבדה. תרכובות המכילות איזוטופים אשר פולטים קרינה מייננת הם מזיקים לבריאות האדם רישוי קפדנית על בקרת תקנות ברמה המוסדית והארצית השימוש שלהם. הניסויים בפרוטוקול זה בוצעו לאחר אימון בשימוש בקוד פתוח קרינה ביוניברסיטי קולג' בלונדון ובעקבות הנחיות לתרגול טוב מעבדה הניתנים על ידי שירותי הביטחון במכללה (הנחיות אווהilable ב http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ). שימוש בקרינה קוד פתוח לא צריך להיות ניסיון קודם הכשרה מתאימה ואישור רגולטורי. גוף התקינה האחראי על קרינה קוד פתוח במחקר מעבדה משתנה ממדינה למדינה. דוגמאות אלה הן: בריטניה, הפועל בריאות ובטיחות ( http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm ), בארצות הברית הוועדה לפיקוח גרעיני ( http:// www.nrc.gov / חומרים / miau / ובתקנות, מדריכים, comm.html ), בקנדה בטיחות הקנדי ועדת גרעיני ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), ובגרמניה דאס Bundesamt für Strahlenschutz ( http : / / www.bfs.de / de / BFS ). משתמשים במדינות אחרות יש לאשר חוקים מקומיים, תקנות רשויות הרישוי שלהם עם קצין בטיחות קרינה. אמצעי הבטיחות הרלוונטיים בפרוטוקול זה כבר ציין בטקסט, מודגשת עם סמל תלתן רדיואקטיבי ( ).

1. הכנת תגובות קינאז

כל תערובות התגובה שהוכנו דוגמיות 1.5ml עם בורג כמוסות המכילות טבעת O כדי למנוע התפשטות של רדיואקטיביות.

1. הפשירי חלבון על הקרח - LRRK2 סוג בר, D1994A, G2019S.
2. להמציא תגובה על הקרח - 10nm LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 5ul של חיץ קינאז 10x, עשה עד 50μl עם מים.

2. הפעלת assay

כל הצעדים ניצול ³² P-ATP צריך לקחת pתחרה באזורים המיועדים קרינה.

מתאים ציוד מגן אישי יש ללבוש - פי נוהל העבודה הרגיל במעבדה שלנו אלה כוללים חלוק, כפפות ומשקפי מגן כפול.

דוגמאות המכיל ³² P-ATP צריך להיות מוגן מפני משתמשים ידי 6mm מסכי פרספקס כדי למזער את החשיפה.

במקרים הרלוונטיים, מכשירי ניטור אישי יש להשתמש - תוך UCL, כל קרינה מוסמך לפתוח משתמש מקור חייב להיות תג הסרט כדי לפקח על חשיפה לקרינה במהלך הניסויים.

משטחים כל ניסיוני יש לבחון על זיהום רדיואקטיבי לפני ואחרי השימוש באמצעות הגייגר הדלפק.

כל מתכלים מזוהמים צריך להיות מסולק הקפדה על הנחיות מוסדיים לסילוק פסולת רדיואקטיבית.

1. לפני תחילת assay, להגדיר אבני חימום עד 30 מעלות צלזיוס ו - 100 ° C, בהתאמה
2. הסר ³² P-ATP מהמקפיא -20 (שימו לב כי תנאי האחסון הלוך ושוב ³² P-ATP עשוי להשתנות בהתאם הספק או סוג של radionucleotides בשימוש). סריקה מחוץ מיכל לפני השימוש, להפשיר מאחורי מסך פרספקס.
3. עם תגובות על הקרח, להוסיף 1μl של ³² P-ATP זה יחד עם 10μM של קר ה-ATP.
4. מערבבים היטב עם פיפטה. צנטריפוגה Pulse להביא נוזל לתחתית של התחתית, מזעור הסיכון של זיהום.
5. הסר aliquot 15μl עבור נקודת זמן אפסד לסיים את התגובה aliquot על ידי תוספת של 5μl של חיץ SDS 4x מדגם denaturation ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. צנטריפוגה Pulse להביא נוזל לתחתית של התחתית, מזעור הסיכון של זיהום.
6. מדגם נותרת להציב בלוק חימום מודגרות ב 30 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
7. 15μl להסיר בשלב 60 זמן תגובה דקה הופסק על ידי תוספת של 5μl של חיץ SDS 4x מדגם denaturation ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. צנטריפוגה Pulse להביא נוזל לתחתית של התחתית, מזעור הסיכון של זיהום.

3. Immunoblotting דגימות וניתוח התוצאות

1. דוגמאות לרוץ על SDS-PAGE
   1. 10 גם 4-12% Bis-טריס ג'ל אלקטרופורזה polyacrilamide מוכן באמצעות מגבים חיץ פועל.
   2. 20μl של המדגם כל הועמסו על ג'ל יחד עם 7μl של הדיאזיםTain סולם חלבון סטנדרטי.
   3. ג'ל לרוץ 160v במשך 90 דקות, או עד לפני לצבוע הגיע לסוף של הג'ל. נוזל כל קשר עם רדיואיזוטופים יש להתייחס כאל פסולת רדיואקטיבית להיפטר הנחיות מוסדיים כמו לכל. UCL תקנות המדינה כי פסולת רדיואקטיבית נוזלית אמור להיות מושלך על ידי ניגרת כיורים המיועדים לרשות רדיואקטיבי עם מים בשפע.
2. חלבון הועברו דרך קרום PVDF כתם המערבי.
   1. חיץ העברת מוכן, 1x טריס גליצין בתוספת מתנול 20%. PVDF ממברנה נייר לסנן לחתוך כדי לתקן את גודל ג'ל והופעל עם מתנול קרחונים במקרה של הממברנה או טרום רטוב עם חיץ להעביר במקרה של נייר הסינון. הממברנה צריכה להיות מראש תווית עם כדורי דיו כדי לאפשר זיהוי של אוריינטציה. הוסר ג'ל מ פלסטIC מעטפת acrylamide עודף להסיר מסולק כמו פסולת רדיואקטיבית.
   2. הג'ל אמור להיווצר לתוך כריך עם קרום נייר פילטר, להבטיח כי בועות לא קיים בין הממברנה ואת ג'ל, וסידר אחר כך במנגנון כתם המערבי עם קרום בין הג'ל לבין האנודה.
   3. ההעברה תבוצע על 25V למשך 16 שעות.
3. בעקבות העברת חלבון PVDF, הממברנה צריך להיות מיובש בטמפרטורת החדר. לבסוף, קרום יבש יש לבודד בין הסדינים אצטט תאית חשוף למסך או זרחן או רנטגן הסרט כדי לאפשר זיהוי של חלבון radiolabelled. זמן חשיפה יכול לברוח כמה שעות יותר משבוע בהתאם לפעילות הספציפית של radioisotope המשמש את האנזים קינטיקה של התגובה.
4. Phosphoscreen סרוקים / סרט מעובד. אם אתה משתמש במסך פוספור, התמונה צריכה להיות נשמר כמו TIFF ברזולוציה גבוהה או קובץ מפת סיביות, אם באמצעות סרט אז טראן כתוצאהsparency יש לסרוק באמצעות סורק שולחני נשמר כמו TIFF ברזולוציה גבוהה או קובץ מפת סיביות. התמונה לאחר מכן ניתן לנתח ImageJ, תוכנית freeware זמין המכונים הלאומיים לבריאות של האתר ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).

4. נציג תוצאות

איור 1 מציג תוצאות נציג assay שבוצעו באמצעות סוג בר, G2019S ו D1994A LRRK2 עם חלבון המיאלין הבסיסי כמו מצע פוספט הגנרית acceptor. Autophosphorylation של LRRK2 גלוי בבית ≈ 200kDa, עם להקות רבות המייצגות MBP phosphorylated גלוי מ 20-40kDa. הערה העדר autophosphorylation בנתיב D1994A (קינאז מת), והגדילה זירחון עקב מוטציה G2019S. הערה שיורית גם זירחון של MBP בנתיב מת קינאז. זה יכול להיות בגלל אבלציה שלם של פעילות קינאז של LRRK2 ידי מוטציה D1994A או לשקף את נוכחות of עקבות זיהום קינאזות התגובה.

באיור 1.

דיון

מאמר זה מתאר את פרוטוקול הבסיסי assaying פעילות קינאז של LRRK2 שימוש במערכת במבחנה. ב את האינטרסים של קוצר, זה הוגבל תבנית של שעה סיום נקודת באמצעות מצע כללי, אבל כללי הפרוטוקול חל על מגוון רחב של מצעים פוטנציאליים מקובל ניתוחים מתוחכמים יותר לבחון את הקינטיקה של פעילות קינאז של LRRK2 . זה מדגיש את אחד היתרונות העיקריים של שימוש במערכת חוץ גופית כדי לבחון את התנהגות קינאז של חלבונים כגון זה: כי יש שליטה מלאה על הריכוזים של האנזים ואת המצע, ניתן להפיק נתונים הקינטית לחשב K _{מ '} ו-V _max ערכי התגובה. עבור הערכות הקינטית מפורט יותר או להעריך את ההשפעה של מעכבי המשוערת, מערכת תפוקה גבוהה יותר (כמו זו הניתנת באמצעות המצע LRRKtide, זמינים Invitrogen) הוא alternati מעולהיש לפנות המתואר כאן.

חשוב, עם זאת, להכיר בכך מודל רדוקציוניסט מערכת שמספקת ב מבחני חוץ גופית kinase הוא רק אחד הכלים לבחון את הביולוגיה של קינאז והיחסים שלה עם מצעים פוטנציאליים. מנתוני מבחני כגון זה יש להשתמש בשילוב עם גישות אחרות כדי לקבל תמונה מקיפה של כמה קינאז מתנהג במבחנה בהקשר הסלולר. לדוגמה, מצע המשוערת phosphorylated במבחנה ניתן לנתח על ידי ספקטרומטריית מסה לזהות phosphosites ייתכן כי לאחר מכן ניתן לטפל על ידי mutagenesis ממוקד (למשל. סרין או תראונין המרת acceptor פוספט שאריות במעלה-phosphorylatable שאריות כמו אלאנין) כדי לבחון את תפקודי ההשלכות של vivo לשעבר זרחון.

שיקול מרכזי בפרשנות נתונים ממערכת חוץ גופית ב assay כגון זה הסבירות either סוג I או מסוג II (חיובי או שלילי שקר שקר) שגיאות. אופי הרדוקציוניסטית של מערכת זו למרבה הצער נפטר אותו שניהם - במקרה של לשעבר, בעל המצע המשוערת מטוהרים מטוהרים קינאז בסמיכות מלאכותי בריכוז גבוה (לעומת הסביבה התאית) יכול לגרום לאירועים זירחון artefactual. לעומת זאת, קינאזות רבים לתפקד כחלק ממכלול בהקשר של התא, דורשים שיתוף הגורמים זירחון של מצע מסוים להתרחש. כפי שצוין לעיל, תוצאה חיובית של זירחון של מצע המשוערת שימוש במערכת assay במבחנה אז צריך להיבדק במערכת התאית כדי לאמת את התוצאה, וגם תוצאה שלילית יש לפרש בזהירות.

לאור זאת, חשוב היכן ניתן לקבל בקרות חיוביות ושליליות כדי לאפשר מחקר השוואתי של פעילות קינאז העניין שלך. בחירה קפדנית של contro חיוביתאני בעל פעילות ידועה כלפי חלבון העניין שלך, יחד עם שליטה שלילית כי סביר phosphorylate המצע המשוערת שלך, הוא יקר מאוד. אחת לשלוט מועמד LRRK2 הוא קולטן אינטראקציה kinase 3, שבה יש רצף העיקרי קשור קשר הדוק לתחום קינאז של LRRK2 אבל יש מבנה שונה מאוד תחום הכולל ^18. זה זמין כמו חלבון רקומביננטי מ Invitrogen והוא משמש כביקורת רגילה במעבדה שלנו.

ראוי גם לציין כי טופס זמינים מסחרית של LRRK2 חסרה את N-הסופית של החלבון ואת מתויג גלוטתיון-s-transferase ואת זה צריך להילקח בחשבון כגורם פוטנציאלי בלבול בעת ביצוע מבחני קינאז עם חלבון זה, כמו לא ידוע מה התפקיד של N-מסוף LRRK2 עשוי לשחק בתפקוד התקין של חלבון זה. אם, למשל, את החלק של N-מסוף LRRK2 כי הוא נעדר החלבון משמש פרוטוקול זההוא קריטי עבור גיוס של מצע מסוים לתחום קינאז של LRRK2 אז זו תהיה השפעה גדולה על זירחון הנצפה אמר המצע של מערכת חוץ גופית שתוארו לעיל.

למרות אזהרות אלה, לעומת זאת, ייחסו חשיבות הביולוגיה של LRRK2 במחקר פרקינסון מדגיש את התועלת של פרוטוקול זה ככלי בעל ערך חוקרת את ההתנהגות של חלבון זה במסגרת חוץ גופית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערה
LRRK2 בר סוג	Invitrogen	PV4873
LRRK2 G2019S	Invitrogen	PV4881
LRRK2 D1994A	Invitrogen	PV6051
קינאז חיץ	Cell איתות	9802S
MBP	סיגמא	M1891
32P g-ATP	פרקין אלמר	BLU002X500UC	500μCi, 30Ci / mMole
חיץ 4x LDS מדגם	Invitrogen	NP0007
2-Mercaptoethanol	סיגמא	M6250
חלבון תקני	Invitrogen	LC5800
מגבים לרוץ חיץ	Invitrעוגן	NP0001
Bis-טריס acrylamide ג'ל	Invitrogen	NP0321	4-12% 1mm 10well
PVDF קרום	Millipore	IPVH00010
העברת חיץ	Invitrogen	NP0006

טבלה 1. ריאגנטים

מזוקקים ו-de מיוננים מים ששימשה את כל הצעדים דילול

סוג ציוד	חברה	הערה
מונה גייגר	מיני מכשירים
טנק SDS PAGE	Invitrogen
העברת טנק	Invitrogen
מחממים אבני (2)	Eppendorf
זרחן מסך	GE	רנטגן הסרט ניתן להחליף
זרחן imager	GE
חשיפה קלטת	GE
סרכזת	Eppendorf
מיגון פרספקס
1.5ml צינורות	VWR	בורג בראש עם טבעת O

טבלה 2. ציוד