דרך מהירה לבצע immunostaining לב עוברי דג הזברה הוא תיאר. לעומת הגישה הר שלם immunostaining, שיטה זו מגדילה באופן דרמטי את החדירה של נוגדנים, אשר מאפשר קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה החושפים מבנים הסלולר / subcellular בלב תוך זמן עיבוד מופחת בהרבה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
עובר דג הזברה הופך פופולרי מודל חוליות vivo לחקר התפתחות לב ומחלות לב אדם עקב אמבריולוגיה יתרון שלה בגנטיקה 1,2. אודות 100-200 עוברי זמינים בכל שבוע מזוג אחד של דגים בוגרים. עוברי שקוף המתפתחים ברחם לשעבר להפוך אותם אידיאליים להערכת פגמים לב 3. הביטוי של הגן כל ניתן להשפיע באמצעות morpholino טכנולוגיית הזרקה או RNA 4. יתר על כן, קדימה מסכי גנטית יצרו כבר רשימה של מוטציות שעלולות להשפיע על היבטים שונים של cardiogenesis 5.
הר שלם immunostaining היא טכניקה חשובה במודל זה חיה כדי לחשוף את דפוס הביטוי של החלבון ברקמות ממוקדות מסוים 6. עם זאת, תמונות ברזולוציה גבוהה שיכולים לחשוף מבנים הסלולר או subcellular היה קשה, בעיקר בשל locat הפיזייון של הלב חדירה לקויה של הנוגדנים.
כאן, אנו מציגים שיטה כתובת אלה צווארי בקבוק ידי ביתור הלב הראשון ולאחר מכן לנהל את התהליך מכתים על פני השטח של המיקרוסקופ שקופית. כדי למנוע אובדן של דגימות לב קטן כדי להקל על הטיפול פתרון, אנחנו מוגבלים דגימות לב בתוך עיגול על פני השטח של המיקרוסקופ מגלשות רתומות עט immEdge. לאחר מכתים, אותות הקרינה ניתן לצפות ישירות על ידי מיקרוסקופ המתחם.
השיטה החדשה שלנו משפר באופן משמעותי את החדירה של נוגדנים, שכן לב מהדגים עובריים רק מורכב משכבות תאים בודדים. תמונות באיכות גבוהה של לבבות שלמים ניתן להשיג תוך זמן התהלוכה הרבה מופחת עבור עוברי דג הזברה בן 2 מיום ליום 6. בשיטה שלנו ניתן להאריך פוטנציאל כתם איברים אחרים גזור מן דג הזברה או חיות קטנות אחרות.
פרוטוקול
1. הכנת שקופיות קאמרית humidified
- החדר humidified ניתן מתיבת כגון תיבת קצה התרוקן. לעטוף גם את החדר ואת לכסות ברדיד אלומיניום כדי להגן על דגימות מן האור.
- בתוך החדר, לשים ערימה של מגבות נייר רטוב כדי לשמור על לחות בתוך החדר, אשר ימנע את דגימות לב מהתייבשות. הגדר microplate קטן בחלק העליון של מגבת נייר כמו מתלה עבור השקופיות.
- צייר או קווים או עיגולים על פני השטח של המיקרוסקופ שקופית באמצעות עט immEdge לעשות בארות דגימות לב ממד על 5x5 מ"מ. בוא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לעומת שיטות קלאסיות immunostaining כל הר, בשיטה שלנו יש את היתרונות הבאים. ראשית, אותות ניאון חזק הרבה יותר ניתן להשיג באופן עקבי בשל חדירה משופרת. ב שיטת הר שלם immunostaining, רקמת העור צפוף המקיף את הלב משמעותית את החדירה של נוגדנים רבים, וכתוצאה מכך רקע גבוה בכל הגוף. בעיה זו חמורה במיוחד עבור עוברי מבוגר יום 3 לאחר ההפריה (DPF). לעומת זאת, רק לבבות גזור מורכבת שכבות תאים ספורים, עיבוד חדירה הרבה יותר טוב. שנית, בגלל החדירה משופרים בהרבה, כל התהליך של immunostaining ניתן להפחי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
אנו מודים Beninio Jomok על עזרתו בעלי דג הזברה. עבודה זו ממומנת על ידי NIH HL81753.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | |
| tricaine | מחקר אורגניים | 3007T | |
| פורמלדהיד | Polysciences | 04018 | |
| מזרק אינסולין | בקטון דיקינסון | 329461 | |
| Triton-X-100 | סיגמא | T8532 | |
| Anti-β-catenin נוגדן | סיגמא | C7207 | |
| Anti-Mef2c נוגדן | סנטה קרוז ביוטק | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinin נוגדן | סיגמא | A7811 | |
| אנטי ודומיו נוגדן | תא האיתות | # 3862 | |
| אלקסה פלואוריד 568 עיזים נגד ארנב IgG td> | Invitrogen | A11011 | |
| אלקסה פלואוריד נגד 488 עיזים עכבר IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| הרכבה בינונית עבור הקרינה | וקטור | H-1200 | |
| ImmEdge עט | וקטור | H-4000 | |
| פולי-L-מסן שקופיות מצופה | במיקרוסקופ אלקטרונים מדעי | 63410-01 | |
| כיסוי זכוכית מיקרוסקופ | דיג | 12-543-D | |
| מיקרוסקופ שקופיות Concaved | דיג | 7-1305-8 | |
| Dissection מיקרוסקופ | לייקה MZ95 | ||
| מתחם מיקרוסקופ | Zeiss | Axioplan2 | |
| ApoTome | Zeiss |
PBST:
1 x PBS
0.5% טריטון X-100
400 מ"ג Tricaine
97.9 מ"ל DDH 2 O
2.1 מ"ל (1M טריס pH9)
התאם את ה-pH 7.0
מקורות
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoe....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
