מהיר In vivo Assay לבדיקת תרכובות neuromodulatory באמצעות מערכת סיבים הענק (GFS) של תסיסנית melanogaster מתוארת. Nanoinjections בראש של חיה יחד עם הקלטות של אלקטרו GFS יכול לחשוף bioactivity של תרכובות על עצב או שריר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Nanoinjection לזווג ו Assay Electrophysiology למסך עבור bioactivity של תרכובות באמצעות תסיסנית melanogaster סיבים הענק מערכת
במאמר זה
סיכום
תקציר
תרכובות סינון עבור בפעילות vivo יכול לשמש כצעד ראשון כדי לזהות מועמדים שניתן התפתח 1,2 סוכני תרופתי. פיתחנו nanoinjection / electrophysiology הרומן assay המאפשר זיהוי של תופעות modulatory ביו של תרכובות על הפונקציה של מעגל עצבי מתווכת תגובה מפלט תסיסנית melanogaster 3,4. שלנו assay vivo, אשר עושה שימוש במערכת הענק תסיסנית סיבים (GFS, איור 1) מאפשר הקרנה של סוגים שונים של תרכובות, כגון מולקולות או פפטידים קטנים, ודורשת רק כמויות מינימליות כדי לעורר אפקט. בנוסף, GFS תסיסנית מציעה מגוון רחב של מטרות מולקולריות אפשריות על עצב או שריר. סיבי ענק (GFS) סינפסה חשמלית (GAP כלאיים), וכן כימי (כולינרגית) על Synapsing Interneuron היקפיים (PSI) ו Trochanteral Tergo שריר תא עצב (TTMn) 5 6. לבסוף, צמתים neuromuscular (NMJ) של TTMn ו DLMn עם קפיצה (TTM) ואת שרירי התעופה (DLM) הם glutamatergic 7-12. כאן, אנו מדגימים כיצד להזריק כמויות nanoliter של המתחם, תוך קבלת הקלטות תאיים אלקטרו ממערכת סיבים Giant 13 ואיך לפקח על השפעותיה של התרכובת על הפונקציה של מעגל זה. אנחנו מראים הספציפיות של assay עם ציטראט methyllycaconitine (MLA), אנטגוניסט nAChR, אשר משבש את PSI כדי DLMn חיבור אבל לא GF כדי TTMn חיבור או פונקציה של NMJ על קפיצה או שרירי התעופה.
לפני תחילת הווידאו הזאת זה קריטי, כי אתה בזהירות לראות ולהכיר את הסרטון שכותרתו "יופיטר הקלטות אלקטרו מן השביל סיב הענק של ד melanogaster "מ אוגוסטין ואח' 7, כמו וידיאו המוצג כאן נועד כהרחבה לטכניקה זו הקיימת. כאן אנו משתמשים בשיטה הקלטות אלקטרו ולהתמקד בפרטים רק על תוספת של nanoinjections לזווג וטכניקה ניטור.
פרוטוקול
1. Electrophysiology לבוש הקמה
- הציוד הנדרש עבור המתקן electrophysiology הגדרת מתואר בפירוט על ידי אוגוסטין et al. על זה כתב העת 14. עיין במאמר זה לקבלת הסבר מפורט של מנגנונים אלקטרו הדרושים.
- שנה קודם לכן תיאר electrophysiology לבוש הגדרת 14 על ידי הוספת micromanipulator 6, המחזיקה nanoinjector. כדי להקל את הגישה בראש של חיה זה צריך להיות ממוקם בין שני micromanipulators אלקטרודה מגרה כפי שמוצג באיור 2.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המבדק nanoinjection / electrophysiology המוצג כאן מאפשר סינון מהיר של תרכובות במערכת העצבים של זבוב הפירות. זהו רומן בטכניקה vivo הדורש כמויות קטנות של חומר כדי לעורר השפעה על מגוון רחב של מטרות מולקולריות במעגל עצבי היטב מאופיין. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לבדוק את bioactivity של תרכובות שונות, החל רעלים מוכרים לסוכנים תרופתי זמינים מסחרית.
כאן הוכיח את הפונקציה של assay שלנו באמצעות MLA, אשר השפיע על מער.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגוד עניינים הצהיר.
תודות
היינו רוצים להכיר את חברי המעבדה מארי ואת המעבדה Godenschwege, במיוחד אלין Yonezawa, להערות ועזרה פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מענק R21NS06637 כדי FM, TAG, א.ב. מומן על ידי מספר קרן המדע הלאומית פרס 082925, URM: לביולוגיה אינטגרטיבית עבור חוקרים עתידיים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
| אלקטרודות זכוכית הקלטה: ההתכה של זכוכית בורו נימים | Precision של מכשירים בעולם | 1B100F-4 | 1.0mm OD, 0.58mm מזהה |
| ממריץ | דשא מכשירים | דגם S48 | |
| מגבר | קבלת מכשירים בע"מ | דגם 5 א | |
| נתונים רכישת תוכנה: Digidata | התקנים מולקולריים | דגם 1440A | |
| נתונים אוסף תוכנות: pCLAMP | התקנים מולקולריים | גרסה 10 | |
| סטראו Wסיבים אופטיים ith מיקרוסקופ טבעת הפנס | AmScope | SM-4T דגם HL250-AR | |
| לנתח את היקף עבור הרכבה | AmScope | SM-2TZ | |
| עפיפון ידני micromanipulator & הטיה מאגר | Precision של מכשירים בעולם | דגם # M3301 העפיפונים: דגם # עפיפון M3-L | |
| תסיסנית melanogaster הפרוע 10E גנוטיפ (זן סוג בר) | Bloomington צילומים מרכז | המניות # 3892 | |
| אנכי פיפטה חולץ | דוד קופף מכשירים | דגם 700c | |
| זכוכית הזרקת micropipettes: ההתכה של זכוכית בורו נימים | Precision של מכשירים בעולם | קטלוג # 4878 | 1.14mm OD, 0.5mm ID |
| הסיליקון שמן | דיג | קטלוג # S159-500 | |
| Beveler | סאטר כלי ושות | KT סוג בראון מק"ט BV-10 | |
| Nanoliter2000 | Precision של מכשירים בעולם | קטלוג # B203XVY | |
| מזון כחול צביעה | מקורמיק | N / A | מרכיבים: מים, פרופילן גליקול, FD & C כחול 1, ו -0.1% Propylparaben (חומר משמר). |
| Methyllycaconitine ציטרט (MLA) | Bioscience Tocris | קטלוג # 1029 | |
| שעווה מקלות פלסטיק | Hygenic Corporation (אקרון אוהיו ארה"ב) |
מקורות
- Koehn, F. E., Carter, G. T. The evolving role of natural products in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 206-220 (2005).
- Miljanich, G. P. Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain. Curr. Med. Chem. 11
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
